异硫氰酸荧光素 (FITC)

异硫氰酸荧光素 (FITC) 

异硫氰酸荧光素 (FITC) 是荧光素的衍生物，可用于包括流式细胞术在内的广泛应用。首次描述于 1942 年，FITC 是用异硫氰酸酯反应基团 (-N=C=S) 功能化的原始荧光素分子，取代了结构底部环上的氢原子。它通常以异构体的混合物形式提供，即 5-异硫氰酸荧光素 (5-FITC) 和 6-异硫氰酸荧光素 (6-FITC)。 FITC 对亲核试剂（包括蛋白质上的胺和巯基）具有反应性。它由 Robert Seiwald 和 Joseph Burckhalter 于 1958 年合成。连接到荧光素核心的琥珀酰亚胺酯官能团形成“NHS-荧光素”，形成另一种常见的胺反应性衍生物，在其他亲核试剂存在下对伯胺具有更大的特异性。

FITC 具有大约 495 nm 和 519 nm 的激发和发射光谱峰值波长，使其呈绿色。像大多数荧光染料一样，它容易发生光漂白。由于光漂白问题，Alexa 488 和 DyLight 488 等荧光素衍生物已针对需要更高光稳定性、更高荧光强度或不同附着基团的各种化学和生物应用进行了定制。此外，一些实验利用 FITC 的光漂白倾向，通过光漂白后的荧光恢复技术来测量蛋白质在膜中的横向迁移率。

异硫氰酸荧光素 (FITC) 理化性质

中文名：异硫氰酸荧光素酯;异硫氰酸荧光素

英文名：FITC-I;5-FITC (isomer I);5,FITC;FITCFluorescein isothiocyanate isomer

CAS号：3326-32-7

SMILES：c1cc(c(cc1N=C=S)C(=O)O)c2c3ccc(cc3oc-4cc(=O)ccc24)O

Inchi：InChI=1S/C21H11NO5S/c23-12-2-5-15-18(8-12)27-19-9-13(24)3-6-16(19)20(15)14-4-1-11(22-10-28)7-17(14)21(25)26/h1-9,23H,(H,25,26)

InchiKey：IRZWHILMNSFEAF-UHFFFAOYSA-N

分子式：C21H11NO5S

分子量：389.38

闪点：398.7±32.9 °C

熔点：360°C

沸点 ：735.6±60.0 °C at 760 mmHg

极化度：41.4±0.5 10-24cm3

密度 ：1.5±0.1 g/cm3

蒸汽压 ：0.0±2.5 mmHg at 25°C

溶解度：丙酮（1mg/ml）；DMSO（5mg/ml）；’乙醇，微溶于水（＜0.1mg/ml）

性状：浅黄色至棕色固体粉末

储藏条件 ：-20°C，避光，在氮气下保存

异硫氰酸荧光素 (FITC) 荧光图谱

异硫氰酸荧光素 (FITC)标记蛋白
1.制备溶于0.1 M碳酸钠缓冲液（pH 9）的待交联蛋白样品，浓度≥2 mg/mL。

【注】：a）勿将碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液存放于0-5℃超过1周，其pH值会发生变化，建议现配现用。b）待标记的蛋白必须是未被污染蛋白，且溶解蛋白的缓冲液里不能含有叠氮钠或胺类试剂，如Tris、甘氨酸，因为这些试剂会抑制标记反应。如果缓冲液里含有上述试剂，则需将该蛋白溶液在4℃下于PBS，pH 7.4 透析过夜；透析过程中如果pH值过高（＞8.0-8.5）会损害某些蛋白。
2. 溶解FITC于无水DMSO配制成浓度为1 mg/mL的溶液。
【注】：于标记实验前新鲜配置FITC溶液，避光。
3. 对于1 mL 蛋白溶液加入50 µLFITC溶液，可按照每次5 µL的量边加边轻轻搅拌蛋白溶液；
4. 待所需FITC加入完毕，将反应液于4℃避光孵育8 h；
5. 加入NH4Cl使其终浓度至50 mM，4℃终止反应2 h；
6. 加入二甲苯青至浓度0.1%，甘油至浓度5%；         
7. 通过大小孔径合适的凝胶过滤层析分离排除未被结合的FITC，分离范围在20，000至50，000（球蛋白例如抗体）。待凝胶柱平衡后，将以上反应混合液从柱顶注入，打开凝胶柱，待其全部流入柱床后，加入PBS缓冲液。
此时，可以形成两条带：a，快速移动带，也就是FITC-蛋白偶联物，先被洗脱，通常于室内光下可看到；b，慢速移动带，也就是未结合蛋白的FITC和二甲苯青。仅仅在PBS缓冲液清洗后被洗脱出来。
8. 于4℃避光储存上述偶联物，加入0.1%（w/v）叠氮化钠作为一种防腐剂。若蛋白浓度较低（＜1 mg/mL），可加入1%BSA作为一种蛋白稳定剂。
9. 偶联物中荧光素和蛋白的比值（F/P）可通过测定495 nm和280 nm处的吸光值来鉴定，F/P应位于0.3-1.0。小于该比例则信号太低，高于该比例则背景太高。

相关案例图示

异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的 GILZ 蛋白 (GILZ-p) (10 µM) 分别刺激 Müller 细胞 6 小时和 12 小时。 通过免疫荧光评估 GILZ-p 在 Müller 细胞中的聚集。 绿色表示 FITC 标记的 GILZ-p，蓝色表示 4 个 6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色的细胞核。 比例尺：50 µm。