还为分子克隆阳性率低烦恼吗？无缝克隆了解一下~
做分子克隆的小伙伴想必都有这一经历：PCR、酶切、连接、转化，仔细检查每一个步骤，可最终筛选阳性克隆时结果依然不尽人意，也想不出究竟哪一步出了问题，导致实验十天半个月完全没有进展，而无缝克隆，一步法构建同源重组载体或许可以解决这一实验难题。
图1 分子克隆示意图
（a）传统克隆（b）无缝克隆
无缝克隆（Seamless Cloning/In-Fusion Cloning），与传统PCR产物克隆的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，进入宿主菌中的线性质粒（环状）依靠自身酶将缺口修复。基于这个原理，汉恒生物开发出了HB-infusionTM 无缝克隆试剂盒。
图2 HB-infusionTM 无缝克隆试剂原理示意图
无缝克隆的优势
1. 相比传统克隆，操作简单，只需要一次反应即可完成定向克隆。
2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到载体的任意位点。
3. 连接片段之间不会引入其他序列。
4. 可以同时克隆多个片段。
无缝克隆操作步骤
1. 制备线性化载体
（1）质粒酶切法：在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化
（2）质粒PCR法：在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段
2. 目的插入片段制备
设计引物进行目的片段PCR 扩增，引物设计要保证目的片段两端有15~25 bp 序列与线性化载体的两端一致（重叠序列的Tm≥48℃，可以按A-T 碱基对=2℃，G-C 碱基对=4℃大致估算）便于拼接反应的进行。
PCR 引物包括5’端与载体同源的15~25 bp 以及目的片段特异性序列20~25bp（见下图3）。PCR 产物经跑胶纯化待用。
图3 PCR上下游引物设计示例
3. 配制无缝克隆反应体系
上述反应体系置于50℃孵育20 min（2-3 个片段拼接）/60 min（4-6 个片段拼接）。反应完成之后若不能马上进行后续操作可将反应样品暂储存于-20℃。
4. 转化感受态大肠杆菌，次日挑取克隆进行PCR或酶切鉴定
以上就是本次的全部内容了，介绍了无缝克隆的原理、优势和实验操作，希望对做分子克隆的小伙伴有所帮助~
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