神经科学研究必备神器—光遗传学技术

简介

光遗传学是一门结合光学和遗传学的跨学科技术，通过外源性表达光敏蛋白，用光控制或检测神经活动。光遗传学技术的开发得益于绿色荧光蛋白的发现和发展。如今种类丰富的荧光蛋白常用于生物标记，使得细胞或有机体的活动实现可视化，有助于更直观地了解生物体的活动规律。在神经生物学领域中，可以让大脑神经细胞随机表达多种颜色不同的荧光蛋白，从而标记不同的神经细胞，即脑彩虹技术；但是如何利用荧光蛋白来显示神经活动，且通过结合某种方法来精确、高效地控制和检测神经细胞活动，是神经生物学家们研究的下一个热点。后来科学家们受到视觉信号传导的启发，感光细胞能够接收光信号并转换电信号，最终传递到大脑，那么能否也类似地通过光刺激来控制神经细胞呢？感光细胞的信号转换需要多种蛋白协同作用，考虑把这些基因一起外源性地表达到神经细胞中，显然是不现实的。但是一个光敏蛋白即可实现这一功能，它属于视蛋白的一种，能够吸收不同波长的激发光导致构象改变，离子通道打开，引起细胞内外电位变化。2002年的一项研究将感光蛋白—变视紫红质表达到体外培养的大鼠神经元中，首次成功利用光控制神经元兴奋，打开了光遗传学的大门[1]。虽然发展过程有坎坷和不被认可，但在2010年被光遗传学技术被Nature Methods选为年度方法，同年被Science认为是近十年来的突破之一，目前在神经科学领域应用十分广泛。

图1 脑彩虹展示结果[2]

光遗传学原理

  实现光遗传学的基本原理主要有三个方面：

    1、  神经元膜电位：神经元细胞内外存在电位差，神经活动会导致细胞膜内外电位产生变化。静息神经元的电位状态为内负外正，活跃神经元的电位状态即变为内正外负。

    2、  光敏蛋白工作原理：光敏蛋白通过吸收不同波长的激发光而打开离子通道，选择性地允许阳离子或阴离子通过（如Na+、K+、Ca2+、H+、Cl-），使得膜电位发生变化，从而激活或抑制神经活动。

    3、  光敏蛋白与荧光蛋白融合表达：荧光蛋白结构可随光敏蛋白结构变化而变得紧密或松散，即可观察到不同强度的荧光变化以显示神经活动情况。

光敏蛋白的主要种类

       光敏蛋白按功能分，有激活型和抑制型两大类，其定位于细胞模上。不同蛋白的激活或抑制的机制不同，下面简单介绍下较为常用的光敏蛋白，更多的种类及特性参数参考表格1[3]。

图2 光敏蛋白离子传导途径示意图[3]

1、  激活型光敏蛋白：

    （1） ChR2（H134R）：视紫红质通道蛋白2（Channelrhodopsin-2，ChR2）的一种突变体，属于光控阳离子通道，在蓝光（最佳激活波长450nm）的激发下打开阳离子通道，使胞外阳离子内流。与ChR2相比，ChR2（H134R）的光敏感性较高，通道关闭速度较慢，因此增加了光电信号，但这也使得它的时间精度不如ChR2。

    （2）  ChETA：ChR2的另一突变体—ChR2（E123T），属于阳离子通道蛋白。ChETA的通道动力学比ChR2更快，降低了光电流幅度。然而，光敏感性大大降低，适用于高频率光刺激，且吸收光谱红移（最佳激活波长490nm），也可与钙离子成像实验同步。

    （3）  C1V1(t/t)：是来自衣藻的ChR1和团藻的VChR1的嵌合突变体，包含两个氨基酸突变—E122T、E162T，因此称为C1V1(t/t)。属于黄光（最佳激活波长535nm）驱动的阳离子通道蛋白。

2、  抑制型光敏蛋白：

    （1） eNpHR3.0：来源于从盐碱古菌中分离出来的嗜盐细菌视紫红质蛋白（Natronomonas halorhodopsin，NpHR），这是一种氯离子泵，属于抑制型光敏蛋白。NpHR在哺乳动物细胞中过表达后定位于内质网，经改造后添加上内质网输出元件和kir2.1钾离子通道的上膜元件，使其能锚定在神经元细胞膜上，并增强光电流，升级为eNpHR3.0。在黄光（最佳激活波长590nm）的刺激下离子通道开放，引起Cl-内流，导致细胞内产生超极化反应，进而抑制神经细胞活动。eNpHR3.0是应用最为广泛的一种抑制型光敏蛋白。

    （2）Arch3.0：来自盐红菌产生的古视紫红质（archaerhodopsin，Arch）的升级版，这是一种质子泵，能够响应黄光或绿光（最佳激活波长566nm），介导胞内H+外流。与其他抑制型光敏蛋白的等效版本相比，Arch具有更高的光电流和光敏感性，且能在轴突质膜中大量表达。然而，通过添加内质网输出元件和神经轴突靶向序列，对其功能进一步增强，升级为Arch3.0，可适用于轴突信号输出的快速抑制。这也使得Arch3.0能够实现稳健、快速且额、可逆的突触抑制。

表1. 光敏蛋白的种类及特性[3]

光遗传学的一般实验方法：

    1、  根据实验目的，选择合适的光敏蛋白，例如需要激活型还是抑制型、激活蛋白的最佳光波长、通道相应速率等等都需要考虑。

    2、  选择合适的表达载体，研究神经活动通常需要进行在体实验，因此腺相关病毒（AAV）较为常用（表2）。即将光敏蛋白的基因信息构建到AAV，使用特异性血清型和启动子还可以实现特定细胞的感染和表达，例如使用Syn启动子在神经元细胞中特异性表达等等。

    3、  光控方式：在特定脑区局部植入光纤，实现时空特异性控制神经元活动；也可通过弥散光大范围控制神经元。

 4、检验方法：电极记录神经元的电生理活动变化；行为学评估神经元活动对动物行为的影响。

表2. 汉恒光遗传AAV现货

总言之，光遗传学本质上是跨学科的，需要可以针对特定细胞的基因调控工具、光传输技术以及光控方法和兼容性数据收集系统。光遗传学的发展开启了神经科学领域的新纪元，实现了对特定神经细胞进行毫秒级的光学控制，极大推动了阿尔兹海默病、抑郁症等疾病的研究，除此之外，也逐渐延申至肌肉、心脏和胚胎干细胞的研究中。

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参考文献：

[1] Zemelman BV, Lee GA, Ng M, Miesenböck G. Selective photostimulation of genetically chARGed neurons. Neuron. 2002 Jan 3;33(1):15-22. doi: 10.1016/s0896-6273(01)00574-8.

[2] Weissman TA, Pan YA. Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 2015 Feb;199(2):293-306. doi: 10.1534/genetics.114.172510.

[3] Yizhar O, Fenno LE, Davidson TJ, Mogri M, Deisseroth K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 2011 Jul 14;71(1):9-34. doi: 10.1016/j.neuron.2011.06.004.