USP22通过其去泛素化酶活性在乳腺癌中正向调节ERα作用

写在前面

        今天推荐的是由中国医科大学生命科学学院在2020年5月12日发表于Cell Death & Differentiation（2020IF：15.828，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Yue Zhao教授，研究表明USP22通过其去泛素化酶活性在乳腺癌中正向调节ERα作用。

研究背景

        雌激素受体α（ERα）是ERα阳性乳腺癌进展的关键因素。针对ERα信号的内分泌疗法是广泛使用的乳腺癌治疗策略之一。然而，此策略难以治疗部分患者。ERα共调节因子的异常表达促进了乳腺癌的发展和内分泌抵抗的趋势。因此，有必要发现调节ERα作用的新型协同调节剂。

摘要部分

        在这里，作者证明组蛋白去泛素化酶USP22在乳腺癌样本中比在良性组织中高表达，并且USP22的高表达与BCa样本中较差的总体存活率显着相关。此外，USP22与ERα相关联，参与维持ERα的稳定性。USP22增强ERα诱导的反式激活。作者进一步提供了USP22与ERα一起被募集到ERα靶基因的顺式调控元件的证据。USP22即使在缺氧条件下和ERα拮抗剂治疗乳腺癌细胞时也能促进细胞生长。重要的是，USP22的去泛素化活性是维持ERα稳定性的功能所必需的，从而增强ERα作用并赋予乳腺癌内分泌抗性。

研究内容

1.USP22在乳腺癌样本中高度表达

        据报道，USP22在多种癌症的病理过程中起着至关重要的作用。作者进行免疫组织化学(IHC)实验表明，与乳腺良性组织相比，USP22在BCa样品中显着高表达。然后作者使用组织阵列（n=124）与BCa患者和GEPIA的生存信息分析了BCa样本中USP22表达与临床预后之间的相关性。结果表明USP22的高表达与BCa样品中较差的总体存活率显着相关。作者还发现BCa样品中USP22的表达与ERα的表达呈正相关。为了探讨USP22和ERα表达的临床相关性，作者在TCGA和cBio Cancer Genomics中分析了来自825名BCa患者的USP22和ESR1编码ERα的表达相关性。有趣的是，USP22表达与4934个基因相关，11,948个基因与临床BCa样本中的ESR1表达相关。其中，2721个基因的表达与USP22和ESR1的表达呈正相关或负相关，表明2721个基因可能参与了USP22调控的ERα介导的反式激活参与BCa的进展。

研究结论：USP22在乳腺癌组织中高表达，USP22的表达与ERα的表达呈正相关。

2.USP22与哺乳动物细胞中的ERα相互作用

        因此，作者转向检查USP22是否与细胞中的ERα相关联。在MCF-7细胞和T47D细胞中进行免疫共沉淀(Co-IP)实验，证明内源性USP22与ERα批次相互作用。使用GST标记的ERαAF1或ERαAF2表达载体进一步进行GSTPull-down实验。结果表明ERα与USP22的结合域主要位于ERαAF2区域。使用生成的USP22突变表达质粒（USP22HH/AA）进行Co-IP实验，该质粒在USP22的去泛素化酶活性中携带功能丧失突变。作者的结果表明ERα用USP22或USP22HH/AA沉淀，表明USP22的去泛素化酶活性不是USP22与BCa细胞中的ERα相互作用所必需的。研究USP22和ERα在BCa细胞中的亚细胞分布细胞，HEK293细胞与ERα和FLAG-USP22表达质粒共转染。作者观察到，无论雌激素处理如何，USP22都分布在细胞核中。ERα主要位于没有E2的细胞质中。在存在E2的情况下，ERα分布在细胞核中并与USP22位于同一位置, MCF-7细胞和T47D细胞也观察到一样的结果。总之，这些数据表明USP22与BCa细胞中的ERα物理相关。

研究结论：USP22与ESR1编码的ERα相关。

3.USP22通过触发ERα的去泛素化来维持ERα的稳定性

        已经证明USP22是去泛素化模块的核心成分，并且USP22与细胞中的ERα相关联，因此作者转而研究USP22是否参与了ERα的去泛素化和维持ERα稳定性。作者的数据显示，在放线菌酮抑制蛋白质合成后，USP22敲低加速了ERα降解，表明USP22保持了ERα的稳定性。同时，与USP22对ERα蛋白的影响相比，USP22 HH/AA降低了ERα蛋白的稳定性。进一步进行了基于免疫沉淀(IP)的泛素化分析，结果表明USP22的异位表达显着降低了ERα泛素化水平。USP22敲低或USP22去泛素化酶失活突变体增加了ERα的泛素化，表明USP22的去泛素化酶活性是USP22对ERα去泛素化和维持ERα稳定性的功能所必需的。总之，这些发现表明USP22通过触发ERα去泛素化来稳定ERα。在不同类型的多泛素化过程中，据报道赖氨酸48(K48)和K63连接的泛素化与蛋白质降解有关，作者接下来探究ERα上的多聚泛素链类型。作者的结果表明，USP22的异位表达显着降低了K63-以及K48-连接的ERα泛素化。为了进一步研究USP22的去泛素化酶活性是否对其减少ERα上多聚泛素链的功能是必要的，将细胞用USP22 wt或USP22UCH突变体（USP22 HH/AA）转染，用于使用HA标记的Ub K48或K63进行基于IP的泛素化测定。作者的结果表明，USP22 wt切割了ERα上K48和K63连接的多聚泛素链，而USP22 UCH突变体则没有。

研究结论：USP22的去泛素化酶活性是USP22对ERα去泛素化和维持ERα稳定性的功能所必需的。

4.USP22的去泛素化酶活性是其对ERα介导的反式激活的共激活功能所必需的

        因此作者接下来探究USP22是否调节ERα介导的转录活性。荧光素酶报告基因检测在MCF-7细胞中进行。USP22显着增强了ERα介导的转录活性。这些结果表明USP22明显增强了ERα作用。作者随后探究ERα中的哪些域受USP22监管。荧光素酶测定结果显示USP22上调ERαAF1和ERαAF2活性。此外，作者想知道USP22对ERα作用的调节功能是否需要去泛素化酶活性。结果表明，与USP22 wt介导的ERα活性增强相比，USP22 HH/AA对ERα诱导的活性几乎没有影响。

        为了探究USP22是否参与内源性ERα靶基因的调节，进行了定量PCR(qPCR)。通过siUSP22敲低了MCF-7或BT474细胞系中的USP22。与E2存在下的对照(siCtrl)相比，USP22缺失显着降低了ERα靶基因的mRNA表达，而USP22缺失对ERα基因转录水平没有影响。作者还研究了USP22对一系列ERα靶基因的蛋白表达的影响。结果显示，USP22的缺失使hTERT、c-Myc和Cyclin D1的蛋白水平下降，而USP22的异位表达使其蛋白水平上升。先前的研究表明，HIF1α的表达直接受ERα的调控，HIF1α的表达与ERα+BCa的内分泌治疗的预后不佳有关。因此，作者转而探究USP22是否在缺氧条件下调节ERα诱导的HIF1α表达。结果表明，USP22缺失明显降低了缺氧条件下HIF1α的mRNA和蛋白质表达。

研究结论：USP22增强了ERα诱导的反式激活，并且USP22的去泛素化酶活性对于其对ERα作用的协同调节功能是必不可少的。另一方面，USP22作为ERα的新型共激活剂，其去泛素化酶活性是USP22对ERα作用的调节功能所必需的

5.USP22和ERα被吸收到ERα靶基因的顺式调节元件

        为了确定USP22或ERα是否被募集到雌激素反应元件（Rα靶基因的顺式调控元件）作者通过ChIP测定，数据显示USP22或ERα被募集到c-Myc启动子的顺式调控元件。此外，USP22的异位表达显着增加了ERα向顺式调节元件的募集。同时，USP22敲低导致对ERα募集的减少。USP22促进ERα募集到ERα靶基因的同一区域。作者进一步研究了USP22是否与ERα一起被募集到ERα靶基因。ChIP-re-ChIP检测在MCF-7细胞中进行。ChIP检测首先使用来自MCF-7细胞的可溶性染色质中针对USP22或ERα的抗体进行。然后，将来自第一个ChIP的沉淀物和上清液分别用针对第二个蛋白质的抗体进行re-IP。数据表明USP22和ERα以组合模式作用于ERα靶基因的顺式调控元件。

研究结论：USP22或ERα被募集到c-Myc启动子的顺式调节元件，且USP22和ERα以组合模式作用于ERα靶基因的顺式调控元件。

6.USP22促进ERα阳性乳腺癌细胞生长     

        为了进一步研究USP22在BCa进展中的潜在功能，作者构建了MCF-7细胞系，其稳定敲低USP22或由慢病毒感染诱导的USP22异位表达。通过流式细胞术在MCF-7细胞中进行细胞周期分布。结果显示USP22敲低显着降低了MCF-7细胞和T47D细胞中S期的比例，从而抑制了细胞增殖。此外，ERα的异位表达部分逆转了USP22敲低后S期比例的降低。这些结果表明USP22参与了细胞周期分布的调控，USP22的功能部分与ERα有关。作者进一步探究了USP22对BCa细胞系中细胞生长的影响。进行集落形成测定以确定MCF-7细胞系中的细胞增殖能力。数据表明，当USP22被敲低时，MCF-7细胞形成的集落数量低于对照细胞(shCtrl)。同时，USP22的异位表达导致集落数量显着增加。然而，在ERα阴性BCa细胞系（MDA-MB-231）中，USP22缺失并未显示出明显的细胞增殖变化。先前已经描述了ERα调节HIF1α途径以赋予内分泌抗性。随后作者检查了在缺氧条件下异位表达USP22的MCF-7细胞系的增殖能力。集落形成试验表明，当添加cocl2时，具有USP22异位表达的MCF-7细胞系形成的集落数量比对照细胞中的多。总之，这些结果表明，即使在缺氧条件下，USP22也能促进细胞增殖。

        为了确定USP22对BCa细胞在体内生长的影响，将携带异位表达USP22的MCF-7细胞系和对照shRNA（Ctrl）分别注射到小鼠的左侧（USP22）或右侧（Ctrl）。随后，作者每周测量肿瘤的大小。相比ctrl-MCF-7细胞的肿瘤，USP22-MCF-7细胞的肿瘤尺寸，体积和四周后的重量都有明显增大。此外，USP22-MCF-7细胞的肿瘤体积比Ctrl-MCF-7细胞的肿瘤体积表现出明显的增长速度。

研究结论：USP22促进小鼠BCa细胞的生长。

7.USP22增加乳腺癌细胞对ERα拮抗剂的抵抗力

        针对ERα信号通路的内分泌治疗被认为是治疗ERα+BCa的潜在方法。ERα拮抗剂ICI182,780可诱导ERα降解并阻断ERα介导的反式激活。4-Hydroxytamoxifen（他莫昔芬）作为ERα拮抗剂可抑制雌激素与ERα的结合，从而抑制ERα的作用。ERα拮抗剂ICI182,780和他莫昔芬对ERα蛋白稳定性和ERα活性的影响。因此，作者转而检查USP22在MCF-7细胞、T47D细胞和他莫昔芬抗性BT474细胞中用E2和ERα拮抗剂处理对细胞生长/增殖的影响。作者的结果表明USP22敲低抑制了E2诱导的细胞增殖，同时USP22的异位表达增加了MCF-7细胞中E2诱导的细胞增殖。此外，USP22的敲低降低了ICI182,780或他莫昔芬对细胞增殖的抑制。此外，USP22的敲低增强了BT474细胞对他莫昔芬的敏感性，并且当MCF-7细胞用USP22转染时，细胞变得对他莫昔芬更具抗性。

研究结论：USP22增加了MCF-7、T47D或BT474细胞对拮抗剂的抵抗力。

结论与讨论

        总之，作者的研究表明,USP22作为ERa蛋白水平的调节剂与ERa结合，参与ERa的K48和K63连接的Ub链的去泛素化,从而抑制ERα降解。另一方面， USP22作为ER信号传导的一个新的共激活器出现，从而促进BCa的细胞生长和增殖。这些结果支持这样一个概念，即USP22是BCa进展的主要驱动因素，也是BCa和内分泌抗性的潜在治疗目标。

Thank you!

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41418-020-0568-2