COIP实验方法及检测报告模板

一、实验目的： 通过免疫共沉淀的方式：用AGO2抗体共沉淀样本中AGO2蛋白及与其互作的蛋白;然后通过WB验证AGO2与CDK1是否存在相互作用。

二、实验材料

l 主要试剂

l 主要仪器及器材

三、实验步骤

1. 蛋白样品制备：

a.收集10^7个细胞至 1.5 mL EP 管内，并用预冷 1×PBS洗涤两次；

b.加入800ul IP裂解液（提前加入蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂），混匀后置于冰上裂解30 min；

c.离心收集上清液(4℃, 17000 g,10 min)，取20ul作为input，于-80℃冻存；剩余样本置于冰上备用（或置于-80℃长期保存）。

2. 磁珠预处理：

a.将ProteinA/G磁珠漩涡振荡1 min，使磁珠充分重悬；

b.取 30µL磁珠悬液置于1.5 mL EP管中,加入200 µL结合液洗涤，进行磁性分离（将EP管放置于磁力架上，使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清）；

c.弃上清液，从磁力架上取下EP管，重复洗涤一次。

d.最后加入200 µL结合液洗涤重悬磁珠以备用。

3. 抗体结合反应：

a.抗体工作液的制备：结合液稀释抗体样品，配制成1:50抗体工作液，置于冰上备用。(抗体具体用量参考抗体说明书)

b.抗体吸附：将步骤 2预处理的磁珠悬液进行磁性分离，弃上清液；加入200µL抗体工作液，迅速重悬后在室温下置于翻转混合仪30 min 后进行磁性分离;

c.洗涤：向EP管中加入200 µL结合液洗涤，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体复合物均匀分散,然后进行磁性分离，弃上清液;

d.重复以上洗涤操作一次。

4. 抗原沉淀反应

a.加入200 µL步骤1中制备的蛋白样品，用移液器轻轻吹打使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。在室温下置于翻转混合仪1 h（或者在 4℃下反应过夜），使抗原与抗体充分结合;

b.将上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离,弃上清液;

c.向EP管中加入 200 µL 结合液洗涤，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，并于四维旋转混合仪上混匀2min，然后进行磁性分离，弃上清液；

d.重复上步骤两次，即共洗涤三遍。

e.最后加入200 µL 洗涤缓冲液，用移液器将磁珠-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5 mL EP 管中，并执行磁性分离，移弃上清。

5. 抗原洗脱：

加入适量Loading Buffer（ 自备）混合均匀，100℃加热10 min。然后执行磁性分离收集上清液进行WB验证或质谱鉴定。

 

 

 

三、实验结果

1. 银染结果

 

2.WB检测结果

 

四、项目内容

广州如期生物技术有限公司成立于2016年，始终以探索科学、服务客户为己任；致力于为高校、科研院所、医院、制药企业提供全面、便捷、专业的技术服务和产品。技术方面我们专注于生物医学领域：公司拥有完善的技术服务平台，覆盖分子生物学，转录组学、代谢组学、蛋白组学，表观遗传等多个科研平台。在产品方面，自主研究多种类型科研试剂盒20多项，如：COIP、CHIP、RIP等科研检测试剂盒，较之同类型的进口试剂盒，极大的降低了科研成本。

公众号：如期生物

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