直播回顾｜ Cre工具鼠系统在实际应用场景中的问题与思考
前段时间，赛业生物产品经理刘凡瑞主讲的「Cre工具鼠系统在实际应用场景中的问题与思考」线上课程，以下为本次直播常见问题汇总与解答。
FAQ:
1.Cre-loxp技术具体工作原理及应用？
2.如何判断Cre工具鼠的基因型？
3.平常实验中Cre工具鼠的特异性鉴定手段及敲除效果如何判断？
4.什么是雌激素诱导型Cre，CreER、CreERT、CreERT2和MerCreMer有什么区别？
5.Cre工具鼠的实验设计及构建方法？
Q
Cre-loxp技术具体工作原理及应用？
A
源自P1噬菌体的Cre-lox系统是控制基因表达的有效特异性系统，由Cre重组酶和loxP位点组成。loxP的反向序列是Cre重特异性酶识别的位点，loxP的间隔序列决定其方向性及重组的结果。
倒置：如果loxP位点位于同一DNA链上并且方向相反，则重组会导致loxP位点之间的DNA区域被反转。
删除：如果loxP位点朝向同一方向，则loxP位点之间的序列被切除为环状DNA片段（并且不被保留）。
易位：如果这些位点位于单独的DNA分子上，则在loxP位点产生易位事件。
Q
如何判断Cre工具鼠的基因型？
A
Cre工具鼠本质是敲入鼠，需要结合配繁方案判断基因型。例如定点敲入的Cre工具鼠在与其他小鼠配繁后会出现基因型分离，通过PCR鉴定可以判断纯杂合；如果是TG打靶的Cre工具鼠，一般只能检测到阳性条带，不能判断纯杂合。
Q
平常实验中Cre工具鼠的特异性鉴定手段及敲除效果如何判断？
A
Cre鼠有通用引物及特异性引物，我们更推荐使用特异性引物进行鉴定。敲除的效果需要注意取材，根据工具鼠表达的部位取材，通过PCR鉴定来判断基因型，通过qPCR来判断剪接后的表达量，通过WB、IF、IHC等手段判断敲除后的蛋白表达情况。
Q
什么是雌激素诱导型Cre，CreER、CreERT、CreERT2和MerCreMer有什么区别？
A
雌激素诱导型Cre是通过将雌激素受体（estrogen receptor，ER）的配体结合区与Cre重组酶相融合，形成定位于细胞质中的融合蛋白（Cre-ER）。在无雌激素诱导剂情况下，其与细胞质中HSP90结合，以非活性状态存在于细胞质，无法发挥Cre-loxP重组系统作用。在雌激素诱导后，融合的Cre蛋白才会通过构象变化从锚定蛋白HSP90上解离下来，进入细胞核，识别基因组上的loxp位点并发生重组。这样就通过控制雌激素的注射时间，可以实现对基因重组时间特异性的调控。
A
Cre-ER是将人类雌激素受体ER结合区与Cre重组酶相融合的诱导Cre。有可能会因动物本身分泌的雌激素影响。为了避免内源性的雌激素的干扰，研究者改造出一种配体结合区发生突变的Cre-ERT（G521R），其使Cre-ER只响应外源的人工合成雌激素（Tamoxifen等）。后面研究者又发现另一种配体结合区包含3个点突变的Cre-ERT2（C400V/M453A/L544A），具有远高于Cre-ERT的敏感性。MerCreMer由Cre重组酶与两侧各有一个突变的鼠雌激素受体 （mer）配体结合域（氨基酸281-599，G525R）组成，可以降低未加药就进入胞核的概率，避免提前泄露。
Q
Cre工具鼠的实验设计及构建方法？
A
Cre工具鼠传统的方法就是通过TG打靶，将Cre随机插入到小鼠体内，如果需要包含更多基因表达相关的调控元件序列的话则使用BAC转基因的方式。这种方式简单直接，目的就是在小鼠体内表达Cre酶，缺点就是不能确定打靶位置，这就可能导致flox与Cre在同一条染色体上，那就无法获得重组后的纯合子。随机插入还会导致其他基因片段被破坏引起小鼠的致死或则异常。随着基因编辑技术的进步，现在多数可以进行精准打靶，通过将Cre基因定点敲入相关内源基因位点，依靠内源性基因调控序列确定Cre表达特征。如果不想破坏内源基因，则可以选择Rosa26、H11这样的安全位点敲入Cre。
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