神经元和星形胶质细胞衍生的外泌体已被确定为筛选阿尔茨海默病（AD）生物标志物的佳来源。然而，很少有研究关注从AD患者血浆中分离的大量外泌体。今天就和大家分享一篇国人佳作，首都医科大学宣武医院贾龙飞团队利用蛋白质组学技术筛查大量血浆外泌体内的蛋白质是否可以作为AD诊断的新型生物标志物。非常荣幸其中非标蛋白质组学以及靶向蛋白验证部分由青莲提供技术支持。

该研究成果于2022年12月5日发表在Alzheimer's Research & Therapy（IF=8.823 ）杂志题为“Proteomic profling ofcirculating  plasma exosomes reveals novel biomarkers of Alzheimer’s disease”。利用非标记定量蛋白组学和平行反应监测技术探讨AD患者组和健康对照组循环血浆外泌体的蛋白质组学特征，并确定其诊断能力。

研究思路

研究成果

01 外泌体收集及外泌体表征

研究人员利用超速离心法获得血浆外泌体，外泌体样品通过透射电子显微镜（TEM）鉴定并展示了来自AD患者（图1A）和健康对照的外泌体代表性TEM图像。蛋白质免疫印记分析显示外泌体标记蛋白Alix在外泌体样品中高表达，而上清液中的标记物为阴性（图1B）。这些结果表明，已从血液样品中成功收集了外泌体。检测了所有样本中CD9、CD63和CD81（图1C-E）的水平，在AD患者和对照组之间未检测到显著差异。

02 血浆外泌体差异表达蛋白的确定

利用非标记定量蛋白组学技术从AD患者组和对照组的血液中一共定量到328种外泌体蛋白。根据差异倍数≥1.2或≤0.80，与对照组相比，AD组中15种蛋白质显著上调，16种蛋白质显著下调。与对照组相比，AD组中检测到的31种差异蛋白质的表达水平如图2所示。

利用PRM技术以验证AD患者组和对照组之间差异表达的31种蛋白质。7个上调蛋白（C1QC、CO9、CFAH、KVD30、GP1BB、RSU1、A0A0G2JRQ6）5个下调蛋白（A2MG、ADA10、A1AG2、IGHA1、HV428）在队列2中显著差异表达。紧接着对12种蛋白质进行了生物信息学分析。GO分析显示大多数蛋白质参与免疫系统和蛋白质级联激活的调节，并在不同的细胞过程中作为结合分子发挥作用，大多数蛋白质定位于细胞外空间和细胞外囊泡（如图3）。KEGG分析结果显示富集的通路与晚发性AD和大脑淀粉样血管病有关。

03 外泌体蛋白诊断组合

研究人员使用诊断（AD与对照）作为因变量，12种蛋白质作为协变量，开发了逻辑模型来评估上述12种蛋白质的功能以区分AD患者组与对照组。在调整年龄、性别、教育年限和APOEε4状态后，发现一组共六种蛋白质（上调：A0A0G2JRQ6、C1QC、CO9、GP1BB和RSU1；下调：ADA10）与AD相关。为了确定六种蛋白组合的诊断能力，通过ROC曲线分析进一步评估了逻辑模型的预测值。结果表明，六种蛋白组合显示出极好的AD诊断能力，曲线下面积（AUC = 0.978，P<0.001）（图4A）明显高于单个蛋白质（AUC = 0.627–0.774），（图4B）表明六种蛋白质的组合对于获得有效诊断是必要的。

总之，研究结果表明一组由六种外泌体蛋白构成的组合是AD潜在的血液生物标志物。该研究为理解AD提供了更多的见解，并表明循环血浆外泌体的蛋白质组分析可能有助于AD诊断，值得在独立队列中进一步验证。