【研究生】流式细胞术原理、荧光通道、流式图、实验对照设计等
一、流式细胞数基本概念：
FCM：流动细胞的度量
特点：
1、在流动状态下，同时检测单个细胞的特性
2、快速
3、特异、灵敏
4、多参数同时分析
流式检测的种类
样本：各种细胞、微生物、人工合成微球等、血清、血浆、培养上清、细胞裂解液
样本制备：单细胞悬液（天然状态：外周血、机械研磨/消化：实体组织）；细胞浓度：5*105-1*107/ml，体积为0.5-1ml，经过300目筛网过滤，防止细胞样本有结块
流式细胞仪的信息：物理结构，抗原、细胞因子表达
二、流式常见应用
三、流式细胞仪组成和工作原理
液流系统：
单细胞在流动池经过激光检测，样本进入废液——气泡会影响，因此上样一定避免气泡
光学系统：
细胞上结合荧光染料，经过激光激发，产生光学参数。分别为散射光信号和荧光信号
散射光信号：
检测细胞相对大小，而不是具体大小
检测细胞相对颗粒度，即细胞的复杂程度，例如细胞器的多少，细胞表面粗糙度
例子：
左侧：人外周全血红细胞，经过红细胞裂解后，上机检测得到的图，淋巴细胞体积最小，复杂程度最低。左下角黑色小点，是样本中的杂质，或者细胞碎片
荧光信号：
荧光染料与细胞通过抗原抗体结合。所以用荧光信号的强弱看细胞抗原的表达量
例如：
外周血制备的单细胞悬液
进行CD19 PE和CD3 FICC的染色
上样，得到双参数散点图
左下角：CD19 PE和CD3FICC表达量都相对低，所以是一群CD3和CD19双阴性的细胞
不同荧光素有独特的激发光谱和发射光谱
激发光谱：能够特异性激发某种荧光素
发射光谱：荧光素被激发后所发出的一定波长范围的光线
滤光片：接收发射光谱
LP500：允许大于500nm的光线通过，小于500nm的光线反射出去
SP500：允许小于500nm的光线
BP500：某一波长范围内的光线，如BP500/50，即500+-25的范围
电子系统：光信号转换成数字信号
四、流式图分析
1、流式图选取：直方图，二维点图，等高线图
直方图：纵轴是细胞数量，是单参数分析
左侧峰，是CD3阴性的细胞；右侧峰是阳性细胞
二维点图：双参数分析
Treg细胞应该在右下方这群，但是与其他细胞没有明显界限，就用到了等高线图
当细胞群不能区分时，可以用等高线试一试，看某个细胞群能否形成一个群体，等高线越密集，说明此处细胞密度相对较高
2、流式对照：阴性对照，单阳性对照
2.1阴性对照：空白对照，同型对照
Y字状结构，是抗体的结构图
细胞在荧光染料进行染色，会出现特异性和非特异性结合（不需要抗原就可以结合），出现两种荧光
2.2阴性对照如何选择同型对照抗体
2.3阴性对照作用
（1）设定实验检测条件
调整散射光电压：即FSC和SSC的电压，看到细胞群体；
调节荧光通道电压：确定阴性细胞位置，阴性对照的信号应该落在左下角
设定阈值：确定观测范围。就是切除部分杂质
2.2单阳性对照——荧光素发射光谱重叠
480nm激光器激发后，FITC发射光谱为绿色峰；PE发射光谱在黄色区域；绿色和黄色透明方块是仪器配置的滤光片的检测范围
PE和FITC的滤光片都有重叠信号，即图中画出的红色标记，就是需要去除的信号
例子：FITC单染管，出现了PE信号
在PE中减去FITC信号
（1）如何设置单阳性对照
1号管：阴性对照管/同型对照管，FITC和PE的同型对照抗体
2号管：FITC的抗体和PE的同型对照抗体
3号管
样本管：加入FITC抗体和PE抗体
（2）补偿模型：双染举例
具体讲解：
正确补偿：图是横平竖直的
肉眼观察图片不一定准确，需要数据统计表看具体数值——Medin
图中正确补偿中，阴性群是64，阳性是69，相近
补偿不足：阳性群太高，需要降到61左右
总结
