基于质谱的蛋白质组学分析是发现新的疾病生物标志物的有力手段。然而，研究设计的某些关键步骤，如队列选择、统计能力评估、样本盲化和随机化以及样本和数据质量控制，往往在实验设计和执行过程中被忽视或不被重视。本教程讨论了设计和实现基于液相色谱-质谱的生物标志物发现研究的重要步骤，并描述了这种研究的每个步骤的基本原理、考虑因素和可能的失败，包括实验设计、样本收集和处理以及数据收集。

生物标志物发展的阶段

生物标志物的发现通常分为三个不同的阶段:发现、验证和确认。

在发现阶段，少量样本被提交进行深入的蛋白质组学分析，其中数千个蛋白质被测量以确定生物标志物候选。通常，更大的样本群会在随后的阶段进行分析，从而增加统计能力。生物标志物候选人也根据其表现在每个发育阶段向下选择，以准确预测疾病或状况。在某些情况下，作为生物标志物测试的是组合蛋白而不是单个蛋白。在验证阶段，候选生物标志物进行额外的蛋白质组学分析，以验证它们在发现阶段相同或类似样本中的身份和表达。一些最有希望的候选药物将在验证阶段进行测试，以确定其临床使用的性能。

发现阶段的注意事项

样本选择时考虑多种变量如生理因素的影响，包括年龄、性别、体重指数、禁食状态、采集时间（昼夜节律或昼夜影响）、月经周期阶段、运动状态、采集季节、医学合并症和干扰药物等。样本收集前需制定标准收样SOP，填写规范详细信息问卷，确定使用的试剂耗材批次类型，如采血管类型，蛋白酶抑制剂，液氮等，避免反复冻融，所有样本采集环境一致。前处理后可根据样品的复杂性，进行高丰度蛋白的去除和增加上机馏分，以增加检测低丰度蛋白质的概率。高丰度蛋白样本例如血浆和血清样本。这类样本蛋白中广泛存在的蛋白种类有10000多种，大多数都是含量非常低的低丰度蛋白。然而往往低丰度蛋白行使着重要的“信使”功能：通知细胞开关信号传导通路，在细胞死亡和疾病发育中扮演着核心角色。因此对低丰度蛋白的识别非常重要。青莲也一直致力于研究提高血液样本鉴定覆盖率的方法，经过多年的摸索和反复的实验验证，青莲即将推出一种特殊材料，能够显著提升血液样本鉴定数量，敬请期待！

下面列出了工作流每一步的主要考虑点。注意，这里展示了一个血浆分析的示例，但是其他样本类型在工作流中可能有一些额外的或更少的步骤。

验证阶段的注意事项

验证阶段的重点是通过定量测量确认疾病组和对照组之间目标肽的丰度存在显著差异。稳定同位素标记的合成肽通常被到关注的样品之中，达到基于靶向质谱来对目标肽进行可靠的检测和定量。

靶向标志物筛选条件

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