水木未来·视界iss.11丨Nature双发！冷冻电镜结构解析对DNA复制及修复的认知重塑

DNA损伤反应（DDR）对于维持基因组的完整性至关重要。当DNA损伤或复制应激发生时，一个检查点信号通路会被自动激活，用于叫停细胞周期并立即启动对DNA损伤的修复，或在无可挽回的情况下触发细胞凋亡。最近，来自范安德尔研究所（VAI）和洛克菲勒大学的研究人员揭示了9-1-1检查点钳(9-1-1 checkpoint clamp)这一DNA修复过程中的关键因子是如何作用于DNA的损伤部位的。

这些成果于3月21日发表在了《自然-结构与分子生物学》杂志上，论文题目是："DNA通过与PCNA钳相反方向的 9-1-1 DNA检查点钳加载"。doi.org/10.1038/s41594-022-00742-6

研究人员写道：9-1-1 DNA检查点钳被加载到DNA的5′端上，在那里它激活了阻止细胞周期的DNA损伤检查点。在增殖细胞核抗原（PCNA）中，加载工作通常由我们熟知的Rfc1-5完成，而9-1-1钳是一个异源三聚体，在酿酒酵母中由Rad24-RFC（hRAD17-RFC）加载。问题就出在这里，我们不了解的Rad24取代了Rfc1的加载工作，这导致9-1-1钳的加载机制一直是个谜，不同于Rfc1将PCNA加载到3′端的连接处，Rad24-RFC会将9-1-1三聚体加载到5′端的DNA连接处。为了弄清Rad24的加载机制，我们分别解析了Rad24-RFC-DNA的9-1-1钳在完全封闭状态和以27Å开启状态下的两个冷冻电镜结构。这项工作阐明了对“细胞如何将遗传指令从一代细胞正确传递给下一代”这一话题的新见解。

研究人员解释说："DNA损伤会产生严重后果，包括癌症和其他疾病。正因为如此，我们的细胞设有一系列的检查和平衡系统，以确保DNA的完整性。我们解析出的9-1-1 DNA检查点钳的高分辨率结构使得我们能够看清它是如何与将其加载到DNA链上的分子相互作用的，从而详细了解DNA修复的基本过程。我们希望这些成果能够被用于开发与DNA损伤有关的疾病的新治疗策略。"

该结构由范·安德尔研究所的冷冻电镜（cryo-EM）解析。解析结果发现，9-1-1 DNA钳不是像所有其他已知的DNA钳那样从3'端加载到DNA上，而是从相反的一端加载到DNA上，即5'端。这一新颖和意外的发现解释了为什么9-1-1可以精准定位DNA的受损位置。为该领域的进一步研究奠定了基础。

转载自Science Daily

"Cryo-EM reveals how '911' molecule helps fix damaged DNA"

于科研小组发布论文的同一天，另一篇记录了斯隆·凯特琳研究所（SKI）的分子生物学家Dirk Remus和结构生物学家Richard Hite的合作研究成果的文章“9-1-1 检查点钳具的加载和释放机制”也发布在了《自然-结构与分子生物学》杂志上。doi.org/10.1101/2021.09.13.460164

他们的发现源于两个具有互补专业知识的实验室之间的合作。Remus博士的实验室使用生化方法来研究DNA复制和修复的过程。他过去几年研究的一个主要目标是在试管中重建DNA的整个复制和修复过程，并排除附近细胞的干扰。

通过长期的努力，Remus博士的实验室已经成功纯化出了修复机制的几个部分，包括9-1-1蛋白质和促进9-1-1与DNA结合的蛋白质。

Remus博士意识到，如果能够以原子分辨率观察这些复合物，它们之间的相互作用将能提供修复过程中每个步骤的图像。就是在这个时候，他向他的同事Hite博士的实验室寻求了帮助。Hite博士是一位结构生物学家，擅长使用一种称为冷冻电子显微镜（cryo-EM）的技术，该技术能够以原子级的分辨率对蛋白质及其内部的氨基酸进行高分辨率的观察。

Hite博士回忆道：“当Dirk来找我们时，我们意识到我们实验室在过去几年中开发的许多工具都非常适合解决他面临的难题。通过冷冻电镜，我们不仅能够确定一种结构，而且能够确定一系列结构。此外，借助新数据和以前的数据，我们能够将这些结构组合在一起成为模型，并提出关于该钳具如何工作的建议。”

这场两个实验室联合进行的结构解析大获成功，并给出了令人惊讶的结果：解析出的结构模型与以前学界公认的结论相悖。

9-1-1钳具的形状像一个环。为了发挥其功能，它需要将断裂的DNA包围在双链DNA片段与单链DNA片段的暴露端之间的连接处。因此，9-1-1钳的环结构必须打开，以允许单链DNA摆动到钳的中心，然后环结构重新闭合。这不是自发发生的，而是由另一种蛋白质复合物，即钳具加载复合物（clamp loader complex）促进的。

Remus博士补充说道："在此之前的所有研究中都认为，钳具将以锁紧垫圈的方式打开，基本上钳具的两个开口端将旋转出平面以产生狭窄的间隙，但Rich观察到的是，9-1-1钳具的打开范围比预期的要大得多，并且它完全在平面上打开，并没有像锁紧垫圈场景中那样的扭曲。”

科学家们指出，锁紧垫圈模型(lock-washer model)已经存在了二十年，并且一直是围绕DNA加载钳子的指导范式。但在这种情况下，这是错误的。

Remus博士还认为这项研究最终可能会带来更好的抗癌药物：许多现有的化疗药物通过干扰癌细胞的DNA复制及修复过程生效。由于癌细胞修复DNA损伤的能力已经降低，添加破坏DNA的化疗药物会压倒细胞修复DNA的能力，并导致它们死亡，例如PARP抑制剂。大胆猜想，也许发现9-1-1的工作原理能让我们设计出更多对DNA复制及修复过程进行靶向干预的药物。

转载自News Medical

"Researchers offer a clear picture of how the 9-1-1 clamp is recruited to sites of DNA damage"

水木未来·视界丨iss. 11