从Nature文章剖析铁死亡和肿瘤微环境结合的研究思路，并告诉你怎么灵活应用生信分析为

肿瘤微环境方向CNS级别文章频发，你还不心动吗？

不知道怎么研究没关系，剖析一下思路立马get！

再从Natrue文章总结生信分析的灵活应用~

今天小云想给大家解读一篇11月份发表的Nature文章，题目是肿瘤中性粒细胞的铁死亡导致癌症中的免疫抑制。从题目中可以看出文章是研究：肿瘤中性粒细胞的铁死亡能够影响免疫抑制的。

那么作者是如何想到要研究这个方向呢？

（1）第一步，需要找到要解决的问题或目前研究的瓶颈：

铁死亡在肿瘤细胞中研究的比较多了，也开发出了一些铁死亡诱导剂用于杀伤肿瘤细胞，在体外细胞实验和免疫缺陷小鼠中的效果十分显著，但在免疫功能正常的动物模型中并没有明显的效果。说明当前的研究只关注了肿瘤细胞本身，而没有关注肿瘤微环境中的免疫细胞！即铁死亡对免疫细胞的影响尚不清楚。

（2）第二步，如何确定要研究哪一种免疫细胞呢？

作者发现2020年有一篇文章报道了人类结直肠癌肝转移的PMN-MDSCs的单细胞转录组分析，结果显示PMN-MDSCs铁死亡途径基因显著富集，表明这些细胞对铁死亡的敏感性更高。

（3）第三步：整理思路，提出假说：

病理激活的中性粒细胞(PMNs)，称为髓系来源的抑制细胞(PMN-MDSCs)，能够抑制抗肿瘤免疫。基于上述的研究进展，作者推测肿瘤微环境中的PMN-MDSCs会更容易发生铁死亡，并会对抗肿瘤免疫产生影响。

福尔摩斯·小云推测：作者的这一想法应该诞生于2020年，然后作者开始设计课题证实猜想，用1年多的时间得到数据并投稿，修修补补就来到了2022年正式被Nature接收并发表。

研究思路

有了研究假说，如何设计课题思路去证实呢？

总结一下可以按照以下流程进行：确定要研究的大体方向/要解决的临床问题→通过文献调研提出科学假说→利用自测/公共数据进行相关性分析→实验验证→组学+生信分析筛选关键分子并验证→增加临床意义（治疗方法+临床数据分析）。

没有思路、不知道怎么利用生信分析的找小云，毕竟分析贯穿了整个课题哦！

（1）通过生信分析证实PMN-MDSC与铁死亡的关系：用自测数据和公共数据

这篇文章的作者是对小鼠和人PMN-MDSC进行了RNA-seq。

分组：①肺癌患者的血液(TBB)和肿瘤组织(TBT)以及健康对照者的外周血(HD)中PMN-MDSCs；②荷瘤小鼠CD14high和CD14−PMN-MDSCs。

生信分析发现肿瘤PMN-MDSCs中参与调节铁死亡的几个基因的上调，说明PMN-MDSCs更易受铁死亡的影响。

基于数据中差异最大的八个铁死亡基因构建铁死亡signature，利用单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据集，证实肿瘤PMNs-MDSCs中铁死亡signature更高。

（2）通过实验验证PMN-MDSCs更易受铁死亡的影响：

利用人和小鼠的PMN-MDSCs验证铁死亡相关指标的变化，包括铁死亡相关基因的表达、脂质分子的累积、铁死亡抑制剂和诱导剂的应用，证实生信分析的结果，即PMN-MDSCs更易受铁死亡的影响，在肿瘤微环境中会发生铁死亡。

（3）实验证实肿瘤PMN-MDSCs铁死亡对T细胞的抑制作用：

用铁死亡诱导剂RSL3处理无肿瘤小鼠的骨髓PMN（BM-PMNs）后，发现能够抑制CD8+T细胞的增殖。利用基因敲除小鼠证实铁死亡缺陷的PMNs对T细胞的免疫抑制作用消失了。而且这种抑制作用是由可溶性因素介导的，因为PMNs上清液能够抑制T细胞增殖，铁死亡抑制剂可以挽救这一效果。说明铁死亡在肿瘤PMN-MDSCs的免疫抑制活性中具有重要作用，但对脾脏PMN-MDSCs没有影响。同时，从肿瘤患者组织中分离出PMN-MDSCs也观察到铁死亡介导的PMNs向免疫抑制的PMN-MDSCs转化。

（4）利用组学和生信分析探究机制并验证：

对铁死亡诱导剂RSL3处理的BM-PMNs进行RNA-seq分析，并对小鼠肿瘤PMN-MDSCs进行代谢组学分析。找到了关键的分子PGE2和脂肪酸转运蛋白FATP2、骨髓过氧化物酶（MPO），并通过实验证实它们的作用。

（5）临床转化意义：

1）通过抑制铁死亡抑制肿瘤生长：

动物模型证实了铁死亡抑制剂对肿瘤的抑制作用，同时铁死亡抑制剂还能增强PD-1抗体阻断免疫检查点的抗肿瘤效果。用Ly6G抗体耗尽中性粒细胞后，铁死亡抑制剂的抗肿瘤作用消失了，表明PMN-MDSCs是铁死亡抑制剂抑制肿瘤的关键细胞。铁死亡抑制剂会增加常驻记忆、中央记忆和效应性CD8+T细胞以及自然杀伤细胞在肿瘤组织中的浸润，并通过scRNA-seq证实了T细胞的激活。

2）临床数据的分析和实验验证：

利用TCGA、免疫治疗等数据集评估铁死亡基因signature与PMN-MDSC、患者生存预后的相关性，发现PMN-MDSC和铁死亡特征之间呈正相关，以及铁死亡基因表达较低的患者生存率显著增加。

总结

这项研究证明在肿瘤微环境（TME）中，PMN-MDSCs会发生铁死亡，这使它们具有更强的免疫抑制性。诱导铁死亡足以使非抑制性PMNs转化为免疫抑制性PMN-MDSCs。虽然铁死亡减少了TME中PMN-MDSCs的数量，但铁死亡细胞释放的免疫抑制分子发挥了对T细胞的抑制作用。抑制 PMN-MDSCs铁死亡能够抑制肿瘤生长。

另外，Nature子刊上的一篇报道发现肿瘤细胞发生铁死亡之后，会对周围抗原递呈细胞产生抑制作用，抑制免疫细胞的功能，促进肿瘤的免疫逃逸。

而且，抑制CD8+T细胞的铁死亡可有效恢复其抗肿瘤活性。

铁死亡在肿瘤中具有双重作用，这些结果进一步突出了铁死亡对于肿瘤微环境的作用。在TME中不同细胞的铁死亡产生的不同效果要加以考虑，可以针对不同的细胞特异性靶向应用铁死亡抑制剂或诱导剂，以取得最佳效果。