细胞生物学【一】
第一章 细胞生物学研究方法
第一节 细胞的形态结构观察方法
一、光学显微镜
（一）普通复式光学显微镜
显微镜的重要参数：分辨率（能区分开两个质点间的最小距离）其高低取决于光源的波长λ，物镜镜口角α（标本在光轴上的一点对物镜的张角）和介质折射率N，其之间的关系是：
光学显微镜可以直接用于观察单细胞生物或体外培养细胞。如果是观察生物组织的样品，需要进行固定、包埋（常用甲醛固定，石蜡包埋）、切片和染色（如HE染色法【即苏木精和伊红染色：碱性染料苏木精和酸性的伊红分别与细胞核和细胞质中的某些成分特异性结合从而改变透射光的波长】）
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
活细胞的显微结构可以借助相差显微镜来进行观察
光波的基本属性包括：波长、频率、振幅和相位。波长和频率的变化表行为颜色的区别，振幅的变化表现为亮暗的区别，相位的变化是人眼无法察觉的（两束光通过光学系统时，会发生互相干涉。如果其相位相同，干涉的结果是使光的振幅增大，亮度增强，反之减弱）。相差显微镜利用这点增强样品的反差，实现对非染色活细胞的观察
【微分干涉显微镜：以平面偏振光为光源。光线经棱镜折射后被分成两束，在不同的时间通过样品，然后再经过另外一束棱镜将光线汇合，使样品中的差别转换成亮暗的差别】
（三）荧光显微镜
在光镜的水平下对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质进行定位性研究
荧光显微镜的样品制备技术包括免疫荧光技术（见第二节）和荧光素直接标记技术（荧光染料DAPI特异性地直接与细胞中的DNA结合，从而显示出细胞核或者是染色体地定位）
（四）激光共聚焦显微镜
在荧光显微镜中许多来自于焦平面以外的荧光会导致观察的图像反差变小，分辨率降低。激光共聚焦显微镜（LSCM）相当于在荧光显微镜上安装了一套激光共聚焦成像系统，并以激光或紫外光为光源，极大的提高了分辨率
二、电子显微镜（EM）
（一）电子显微镜的基本知识
1.与光镜的区别：用电子束作为光源
2.分辨率和分辨本领：分辨本领是指电镜在最佳状态下的分辨率
3.电子显微镜的基本构造【略】
（二）主要的电镜制样技术
1.超薄切片技术：固定（戊二醛和四氧化锇【即锇酸】）、包埋（包埋前要经过脱水处理【包埋剂大多都是疏水性质】）、切片和染色（用重金属盐进行染色）
2.负染色技术
用重金属盐（磷钨酸或醋酸双氧铀）对于铺载在载网上的样品进行染色，吸去多余染料，样品自然干燥之后，整个载网上都会铺满重金属盐，从而衬托出样品的精细结构
3.冷冻蚀刻技术
分为冰冻断裂和蚀刻复型技术。图像具有立体感
4.电镜三维重构与低温电镜技术【略】
5.扫描电镜技术
电子枪发射出的电子束被磁透镜汇聚成电子探针，在样品表面进行扫描，激发样品表面释放出二次电子。二次电子被感受器接收，并转换成光信号，其产生多少和样品表面有关。所以扫描电镜可以得到样品表面的立体图像结构信息
三、扫描隧道显微镜（STM）
利用量子力学中的隧道效应，即在通常电压下，两电极之间有很大的阻抗，阻止电流的通过，称为势垒。当两电极之间近到一定的距离（50nm以内）时，电极之间产生了电流称为隧道电流，即隧道效应。且隧道电流和针尖的距离呈指数关系，由此样品表面的形貌可以测定。
第二节 细胞及其组分的分析方法
一、超离心技术
利用各种技术将细胞质膜破碎，形成各种细胞器和细胞组分组成的混合匀浆，再通过差速离心将各种不同质量和密度的亚细胞组分分开
密度梯度离心是将要分离的细胞组分铺放在含有密度逐渐增加的高溶解性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面，通过重力或者是离心力使样品中的不同组分以不同的速率进行沉降
速度沉降用于分离密度相近而大小不一的细胞组分，离心前将要分离的物质放在溶液的上层，各种细胞组分再根据其大小以不同速度进行沉降，形成不同的沉降带
等密度沉降主要是用于分离密度不一的细胞组分，细胞组分在连续梯度的高密度介质中经离心力场长时间作用沉降或漂浮到与自身密度相等的位置，形成不同的沉降带
二、细胞成分的细胞化学显示方法
利用显色剂与某一细胞组分特异性结合的性质
福尔更反应可以特异性地显示呈紫红色的DNA的分布
PAS反应通过醛基和碱性品红反应产生紫红色化合物确定多糖的存在
四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈现黑色，用来证明脂滴的存在。而苏丹Ⅲ（深红色）染色则通过扩散进入脂滴之中，使脂滴着色
米伦反应用氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应，形成红色沉淀。
在重氮反应中，氢氧化重氮与酪氨酸、色氨酸和组氨酸起反应，形成有色复合物
蛋白质中的巯基可用形成硫醇盐共价键的试剂进行检测
三、特异蛋白抗原的定位与定性
（一）免疫荧光技术
用免疫学方法（抗体-抗原结合）与荧光标记技术相结合用于研究特异性蛋白质在细胞内的分布（分为直接【荧光分子与第一抗体结合，第一抗体识别抗原】和间接【荧光分子与第二抗体结合，第二抗体识别第一抗体-抗原复合物】两种方法）
（二）免疫电镜技术
分为免疫铁蛋白技术、免疫胶体金技术和免疫酶标技术，三者区别在于与抗体结合的标志物不同
四、细胞内特异核酸的定位与定性
常采用原位杂交技术，用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核酸序列在染色体上的定位
五、定量细胞化学分析与细胞分选技术
流式细胞术可以定量的测定某一细胞中DNA、RNA或某一特异的标记蛋白的含量，以及细胞群体中上述含量不同的细胞数量，还可以用于细胞的分选或者是分离某一特意染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来
第三节 细胞培养与细胞工程
一、细胞培养【略】
二、细胞工程【略】
第四节 细胞及生物大分子的动态变化
一、荧光漂白恢复技术【略】
二、单分子技术
分为单分子光谱及成像（基于分子的内凛光谱以及与周围环境和分子的作用来测量单一分子对于光的响应或者是对于化学条件的响应）和单分子操纵及力学性质测量（常见方法有光摄、磁摄和原子力显微镜）
三、酵母双杂交技术
利用单细胞真核生物酵母在体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的系统。
细胞的转录起始需要转录激活因子的参与，转录激活因子一般由两个结构域构成，即DNA结合结构域和转录激活结构域。酵母双杂交利用此原理：证明A是否与B蛋白在细胞中发生作用，或者是寻找与蛋白A可能发生作用的蛋白，可以分别制备DB（DNA结合结构域）和蛋白A的融合蛋白（即诱饵，bait），以及AD（转录激活结构域）与蛋白B或可能与蛋白A发生作用的融合蛋白（即猎物，prey）。如果蛋白A与蛋白B或者是其他蛋白在细胞内相互结合，将会形成与转录激活因子相类似的复合物，启动报告基因的表达
四、荧光共振能量转移技术（FRET）
用来检测活细胞中两种蛋白分子是否直接相互作用。
在一定的波长激光的照射下，只有携带发光基因的分子才可以激发出波长为A的荧光，而同一激发光无法激发携带发光集团B的荧光。当供体所发出的荧光光谱A与受体上的发光集团吸收光谱相互重叠，并且两个发光集团之间的距离小到一定程度时（10nm）就会发生不同程度的能量转移，即受体分子的发光集团吸收了供体所发出的荧光，并放出了波长为B的荧光，由此认为这两个蛋白有直接相互作用
五、放射自显影技术
利用放射性同位素的电离射线对乳胶（含有溴化银或者是氯化银）的感光作用，对于细胞中的生物大分子进行动态研究和追踪
第五节 模式生物与功能基因组的研究【略】
第二章 细胞质膜【略】
