USP3严格调控泛素介导的DNA损伤应答以维持造血干细胞功能的完整性
写在前面
今天推荐的是由荷兰癌症研究所团队在2014年8月25日发表于Journal of Experimental Medicine（IF：11.142，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Elisabetta Citterio教授，研究表明USP3通过调控泛素介导的DNA损伤应答可以维持造血干细胞功能的完整性。
研究背景
保持基因组的完整性对生理过程至关重要，包括干细胞和组织的稳态以及肿瘤的避免。为了保护基因组免受各类遗传毒素的持续攻击，细胞进化出了高效的机制，统称为DNA损伤应答（DDR）。USP3是一种染色质相关的去泛素酶(DUBs)，先前发现其在逆转组蛋白H2A和H2B的单泛素化方面具有高度活性。目前有几项研究表明USP3的活性与DDR相关。DNA断裂时的组蛋白泛素化是激活DDR和DNA修复所必需的。DUBs在体内在是如何动态去除这种修饰，从而影响基因组的完整性，目前还不得而知。
摘要部分
作者构建了一株USP3缺失的小鼠Usp3 ∆/∆，结果发现，USP3的缺失增加了成年组织中组蛋白的泛素化水平，随着时间推移还减少了造血干细胞(HSC)储备，并缩短了动物寿命。作者的数据表明，USP3在维持HSC的稳态、自我更新、体内再生潜能和体外增殖方面具有重要作用。缺陷的DDR和未解决的自发性DNA损伤导致Usp3 ∆/∆-HSCs的细胞周期受限。除了造血系统外，Usp3 ∆/∆小鼠还自发形成肿瘤，而原代Usp3 ∆/∆细胞未能保持染色体的完整性。研究表明，染色质泛素化的调控通过调节遗传毒性应激的反应以维持组织功能。
研究内容
1.USP3缺失的小鼠出生后正常发育但其全基因组中H2A和H2B的单泛素化增加
为研究USP3的生物学作用，作者构建了一株USP3缺失的小鼠（Usp3 ∆/∆）并在蛋白和mRNA水平上分别验证了USP3的缺失。结果显示，Usp3 ∆/∆幼鼠正常出生且符合孟德尔比例，无明显的异常表型。
作者使用泛素化底物FK2的抗体进行免疫荧光分析。实验显示，Usp3∆/∆-MEF细胞中的FK2信号强于WT。进一步研究发现，与WT相比，Usp3∆/∆-MEF中单泛素化的组蛋白H2A（uH2A）和H2B（uH2B）水平更高。体内实验也表明染色质结合的FK2的Ub信号和uH2A/uH2B水平增强。
研究结论：USP3对于胚胎和出生后的正常发育是不必要的，但它对于抑制uH2A和uH2B在成体组织中的累积是必要的。
2.USP3缺失导致小鼠寿命缩短、癌症发病率升高以及MEFs出现自发的遗传毒性应激
作者监测了Usp3 ∆/∆（n=34）和WT（n=26）小鼠直到90周龄。结果显示，与WT相比，Usp3 ∆/∆小鼠的寿命明显缩短且其成体组织功能下降。此外，在34只Usp3∆/∆小鼠中，有11只产生了自发性肿瘤，表明Usp3 ∆/∆小鼠的无瘤存活率显著降低。
接着作者探究了USP3缺失对基因组完整性的影响。实验结果显示，与WT相比，Usp3 ∆/∆-MEF中DNA的自发性断裂显著增加了，染色体断裂和结构异常也有增加。
姐妹染色单体交换（SCEs）的频率是染色体不稳定性的一个指标。作者将WT和Usp3 ∆/∆-MEFs中的p53敲除（shp53 MEFs）来实现永生化。实验表明，Usp3 ∆/∆-shp53 MEFs中自发的SCE频率显著高于WT。
研究结论：Usp3 ∆/∆小鼠更容易出现组织功能衰退和自发性肿瘤。此外，USP3在维持基因组完整性中发挥重要作用，其功能的缺陷与遗传毒性应激密切相关。
3.USP3缺失的小鼠随着年龄增长出现淋巴细胞减少症
作者着手研究USP3缺陷对造血功能的影响。作者分析了10-17以及44周龄（老年）小鼠的外周血。结果发现Usp3 ∆/∆老龄小鼠的白细胞（WBCs）数量与同笼WT小鼠相比显著减少，这表明Usp3 ∆/∆小鼠的造血系统中存在年龄相关的细胞减少现象，特别是淋巴细胞。
接下来，作者通过流式细胞术对结果就进行量化。结果发现，在Usp3 ∆/∆小鼠的BM（骨髓）中显示出不均衡的造血。FACS分析显示，老年Usp3 ∆/∆小鼠的淋巴室（CD19+）显著减少，而17周龄的Usp3 ∆/∆小鼠并没有。另外，所有B细胞亚群仅在老年的Usp3 ∆/∆小鼠中有相当水平的减少。
研究结论：USP3的缺失显著影响造血功能，特别是导致B和T淋巴细胞系出现年龄依赖性的减少。
4.Usp3 ∆/∆小鼠的造血干细胞和祖细胞室出现质和量的缺陷
作者对17和44周龄小鼠的LSK区室（富含HSCs）进行多参数流式实验。分析显示，Usp3 ∆/∆小鼠在两个年龄段的LSK数量都显著减少。进一步的研究表明USP3是维持该区室表型正常所必需的。
LSK区室包括长期的LT-HSC、短期的ST-HSC亚群以及多能祖细胞（MPPs）。作者发现，USP3缺失导致老年小鼠中的三个原始细胞群的绝对数量显著降低。相反，17周龄的Usp3 ∆/∆小鼠仅显示出ST-HSC和MPP减少。此外，USP3缺失导致17周龄时的普通淋巴祖细胞（CLPs）显著减少，而CMPs、GMPs或MEPs的数量变化很小。
研究结论：USP3的缺失对HSC、LSK和CLP区室的大小有显著影响，且这种影响随着年龄增长而加大。表明USP3是维持成体中HSC的正常功能所必需的。
5.USP3缺陷的HSCs表现出细胞自主性功能衰退
作者通过小鼠的辐射-移植实验发现，与WT供体相比，Usp3 ∆/∆ BM细胞的重建能力有中度但显著的降低，但Usp3 ∆/∆供体对重建淋巴B和T谱系的作用很小。此外，在12 wpt时，Usp3 ∆/∆ BM次级受体的LSK群体比WT显著减少。
作者将小鼠暴露于5-FU的环境中并探究应激诱导的造血过程中HSCs的稳态。结果显示，任何年龄的Usp3 ∆/∆小鼠中均没有检测到BM细胞减少，然而连续注射5-FU的条件下，老年Usp3∆/∆小鼠的BM重建能力出现缺陷。
最后作者进行了LTC-IC实验。作者从15-17周龄的Usp3 ∆/∆和WT小鼠中纯化了Lin—·细胞。长期培养后，Usp3∆/∆的Lin-细胞在甲基纤维素中的克隆形成能力显著降低，表明Usp3∆/∆原始造血细胞的活性降低。
研究结论：无论是稳态条件还是应激诱导的造血过程中，USP3对HSCs的细胞自主性功能十分关键。
6.USP3缺陷的HSCs在体内外均遭受更大的DNA损伤
作者对DDR激活标记物H2AX进行免疫染色，结果发现，Usp3∆/∆的LT-HSC和ST-HSC中显示出很高的H2AX阳性且有多个集落，而WT HSCs中很少。
作者进行碱性彗星试验以检测DNA断裂。结果显示，老龄Usp3 ∆/∆小鼠的LSK和BM细胞中检测到明显更高比例的彗星尾，反映了DNA断裂的累积。
接下来作者探究了Usp3∆/∆ HSCs在压力诱导的强制增殖中是否发生DNA损伤。对H2AX和53BP1克隆的分析表明，Usp3∆/∆ LT-HSCs中DNA损伤增加。另外，DAPI分析显示Usp3∆/∆ LT-HSCs中微核率较高，微核形成是遗传毒性应激的标志物。
研究结论：USP3在维持HSCs的基因组完整性中起着不可或缺的作用。
7.细胞衰老是Usp3∆/∆-BM缺陷的基础
作者在BM细胞上检测衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性。结果显示，与WT相比，Usp3∆/∆的SA-β-gal阳性衰老细胞增加了6.5倍。免疫染色显示，异染色质标记物H3K9me3和异染色质蛋白1Υ(HP1Υ)在Usp3∆/∆-LSK中高表达和局部富集，Usp3∆/∆-BM中也是如此。这些表明，USP3缺失的LSK和BM细胞在体内表现出明显的异染色质作用和SA-β-gal活性。
然后作者探究细胞因子诱导的复制对LT-HSCs的影响。实验显示，WT LT-HSC正常扩增，而Usp3∆/∆细胞表现出有限的分裂，传代后更明显，且随后异染色质增加。最后为了检测复制应激对LT-HSC的影响，作者将细胞暴露于c-Myc。结果发现，Usp3∆/∆ LT-HSC在Myc表达时SA-β-gal的活性明显更高。
研究结论：Usp3∆/∆-HSCs在细胞因子和癌基因诱导的复制应激条件下进行细胞周期限制。
8.USP3保护HSCs和小鼠免受IR
作者测试了USP3 ∆/∆小鼠在IR后从急性遗传毒性应激中恢复的能力。结果显示，辐射后的USP3 ∆/∆小鼠在第9天左右体重降低，并在第10-16天全部死亡。而60%的WT小鼠存活下来。
作者还分析了LT-HSC在体外对IR的反应。作者发现，WT和Usp3∆/∆ HSCs在接受2Gy辐射后表现出类似H2AX和53BP1集落形成。然而，在IR后24 h，尽管绝大多数IRIF在WT细胞中被消除，但在Usp3∆/∆细胞中仍存在相当一部分H2AX和53BP1集落，这表明DSB修复延迟，且伴随着微核数量的增加。
研究结论：USP3缺陷的HSCs在体内外对遗传毒性应激更为敏感。USP3是体内DDRs过程中的关键效应蛋白
结论与讨论
作者研究了USP3在体内功能丧失的结果，并发现去泛素化对于维持生理条件和应激反应下的组织稳态至关重要。研究表明，体内的去泛素化和泛素化在抑制遗传毒性应激的过程中同样重要。总之，USP3缺失的小鼠模型证实了USP3在抑制慢性遗传毒性应激和HSCs衰老方面的重要性。此外,作者还强调了染色质去泛素化的分子机制。
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原文链接：https://doi.org/10.1084/jem.20131436
