摘 要

        随着测序技术的快速发展，整合了环境DNA、DNA条形码和高通量测序的 eDNA 宏条形码技术已经成为当前研究热点之一，同过取样环境DNA利用高通量测序和生物信息学分析对取样环境的某物种或物种丰富度进行检测。虽然其准确性易受数据库质量影响，但自身取样方便、检测范围广、通量高等特点符合当前的研究趋势。结合已报导的文献，本文论述eDNA宏条形码技术的常规操作流程和在实际中的应用，并对未来发展进行了展望。

关键词：Environmental DNA;条形码;高通量测序;物种检测

1. 引言

        eDNA（Environmental DNA），是在没有预先分离任何目标生物的情况下从环境样本中捕获的DNA，eDNA可以从现代环境（如海水、淡水、土壤或空气）或古代环境（如沉积物、冰或永久冻土中的岩心）获得。该词最早可追溯到1987年，在当时是用来调查沉积物中微生物的一种方法。如今，在脊椎动物和无脊椎动物的研究中都可以看到eDNA方法的使用。

        DNA宏条形码（Metabarcoding）是条形码（Barcoding）与高通量测序（High-throughput sequencing，NGS）的结合，选取条形码序列的一段（如COI的某段序列，100~200bp）作为分子标记，将混合样本（如eDNA、群落DNA）作为模板，扩增完成后进行高通量测序，获得测序结果后再进行生物信息学分析，将每条正确的测序序列与不同物种一一对应。

        人类基因组计划推动了测序技术的高速发展，2000年初，第一个真正的高通量测序平台发布，再历经20多年的发展，测序成本早已不像当初那样昂贵，因此高通量测序的应用更加广泛[1]。测序技术的发展是推动eDNA宏条形码技术成为研究热门的重要因素，同时，利用DNA条形码来鉴定物种时，只需要一小段DNA，这也正好避开了高通量测序在长片段测序方面的劣势。

        eDNA宏条形码技术可用于研究物种丰富度评估和单一物种检测，已报道文献中，研究对象包括植物[2]、动物[3]和微生物[4]，在进行单一物种检测时，高通量测序几乎派不上用场，但需要根据检测的物种设计特异性探针。eDNA宏条形码技术还可能获得我们意料之外的结果，如检测到还未在本地报道过的生物的DNA，或许本地真的存在这种生物，只是还未被发现，同时也有可能是测序错误以及数据库中的同源性序列存在错误。eDNA宏条形码技术和其它技术一样也有自身的局限性，确保eDNA的质量、降低测序成本、扩充数据库信息将进一步推进eDNA宏条形码的发展。

2. eDNA宏条形码技术的基本流程

        基于二代测序的高通量eDNA宏条形码技术可分为三个流程采样流程、测序流程和分析流程。在进行eDNA取样时，不同的生境取样方式存在区别，但目的都是为了获取无脊椎动物残留在环境中的DNA，液体样最后都需要经过过滤装置，使DNA吸附到滤膜上，王月等在研究中发现使用混合纤维素膜吸附DNA后续得到的PCR产物最多[5]。若初始样品为非液体，则需要用其它方法，如对于粪便样品，可购买粪便样品DNA提取试剂盒来使用[6]。在PCR扩增中常将eDNA中的DNA条形码序列的某一段作为模板，选择合适的引物，引物可以自己设计也可从已发表文献中获得。扩增体系、扩增循环次数、各种温度则需要根据文献或实验室经验来摸索。

        在获取一定质量和数量的DNA后，可进入接下来的测序流程。目前Illumina公司生产的二代测序仪仍然为市场主流，二代测序的特点是边合成边测序，测序前给每段序列加上标签，经桥式PCR将不同序列进行扩增，形成不同的簇，簇是为了放大脱氧核糖核酸核苷酸（dNTP）所带的荧光信号。不同的dNTP带不同的荧光信号，在其3’端还携带一个阻碍合成的基团，按顺序记录不同的荧光，获得测序结果。

        测序结果并不能直接使用，需要进行初步分析，如是否有序列过度出现、是否存在嵌合体等。对测序结果进行筛选后，将余下相似性较高的序列（>97%）看作一个OTU（operational taxonomic units），多个OTU可能对应一个物种。随后将不同序列在数据库（如ncbi，也可以是实验室自己搭建的数据库）中进行比对，尽量将每条序列鉴定到最小分类单位。

3. eDNA宏条形码的应用

3.1. 物种丰富度检测

        物种多样性是反应生态系统是否稳定的一个重要指标，良好的生态系统可以创造不菲的经济价值，而外来物种入侵[7]、自然灾害[8]和人类活动[9]都可能对生态系统造成破坏，仅在2016-2018年期间中央财政在重点生态保护修复专项中就拨款260亿元。在生态环境的评估中常利用无脊椎动物，因为它们的个体小，种类庞大，当利用eDNA宏条形码技术时，从2ml试管水样中，就能获得大量的无脊椎动物信息，这些无脊椎动物大部分来自昆虫纲。昆虫是动物界第一大门的第一大纲，昆虫已知种类数量多达100多万种，据推测，整个昆虫群体可能有1000多万种，甚至可能是3000多万种。历经数亿年的演化，昆虫家族的成员在习性与食性上出现了巨大差异，因此几乎任何一种生态系统中都有多种昆虫存在，但海洋除外，科学家猜想是由于海洋上并不存在为昆虫提供栖息地的植物[10]。

        在已报道的文献中，水环境是被研究的最多的，水可以有效的溶解生物个体释放到环境中的DNA，同时水体取样也相对方便，鱼类多样性监测相关文章中涉及到eDNA宏条形码技术的比例正在逐年上升[11]。在获取昆虫等其它体积微小的动物的eDNA时并不容易，在采样牛粪时就可能无法剔除一些微小的虫卵[6]。群落DNA（Community DNA）可以弥补这一缺陷，从环境样品（如土壤或水）中提取生物体个体，再将个体进行混合后提取的总DNA，该技术被称为群落DNA宏条形码技术（Community DNA metabarcoding），除了获取DNA的方式有所区别，后面的分析流程一致。实际上，这些被用于提取群落DNA的个体也可能携带一些非自身DNA，即群落DNA中含有eDNA。收集群落DNA要相对简单，如利用昆虫诱集灯采样结合宏条形码技术来比较不同生境下的昆虫多样性[12]。Zhenhua Sun等使用网扫和陷阱诱集从水底获得样本经形态鉴定后再将它们统一浸制在70%乙醇中，随后抽滤酒精吸附酒精中的DNA通过宏条形码技术研究距公路不同距离的池塘中大型无脊椎动物的组成差异[13]。

3.2. 单一物种检测

        物种监测可用来追踪和发现一些稀有物种，以便我们更好的摸查和保护这些稀有资源，同样是在水环境，eDNA可被用来监测长江江豚（Neophocaenaphocaenoidesasaeorientalis）[14]。红外相机是在野外调查大型脊椎动物时常用的方法[15]，但红外相机不容易拍到一些极稀有物种，拍摄过程中容易受人类放牧活动影响。可以通过昆虫等无脊椎动物特殊的习性如食粪、食腐、寄生吸血等特点来从这些无脊椎动物中获得脊椎动物的DNA，达到监测的目的[16]。在2012年，科学家提出通过热带水蛭来获取有亚洲独角兽之称中南大羚（Pseudoryx nghetinhensis）的DNA，进一步对其进行研究[17]。

        除了用于寻找稀有保护动物的踪迹，eDNA还被用来监测外来物种的入侵。在2003年-2016间我国正式公布的入侵害虫有26种，仅稻水象甲每年危害水稻面积约15万公顷，造成经济损失约4.3亿元。虫灾的爆发需要昆虫的种群密度达到一定值，如蝗灾的爆发需要每平方米存在6-10只蝗虫。若我们在物种入侵的早期就检测到它的存在就能及时准备好应对措施，降低损失。目视调查是野外早期调查的常用调查方法，但其费时费力，而且严重受外界环境影响以及昆虫个体大小影响。现在有利用eDNA来检测入侵害虫的相关案例，在斑衣蜡蝉（Lycorma delicatula）入侵美国北部时，Rafael E. Valentin等人根据其在取食植物汁液时排出蜜露这一特点利用，利用滚轮法和喷雾法收集其蜜露，最后利用特异性探针成功检测到斑衣蜡蝉DNA[18]。

4. 讨论

        eDNA宏条形码技术是一种迅速兴起的方法，能够弥补传统分类方法目前的一些不足。无论是物种丰富度评估还是单一物种检测，传统分类需要采集大量样本并通过形态学鉴定将每一个个体鉴定到科、属、种，这不仅需要过硬的专业知识，而且要在采样和整理样本的过程中耗费大量时间。在进行形态学鉴定时还要求个体必须完整，而对于个体微小和特征不明显的昆虫，传统分类方法则可能导致错误的结果。eDNA宏条形码技术也有自身的局限性，如下：1.DNA在周围环境中的留存时间，不同的生物体释放DNA到环境中的速率不同，同时DNA在不同环境中的降解速率也不同；2.eDNA在采样、提取和储存过程中易受污染；3.物种特异性DNA条形码的可用性取决于已有数据库的质量，在多数研究中，一些物种只能确定到科或属是因为数据库中比对到的序列没有鉴定到种，而且在NCBI中，DNA条形码大部分为COI序列，其它类型的DNA条形码序列相对缺乏；等。

        eDNA宏条形码技术的广泛使用与测序技术的发展息息相关，一代测序和三代测序由于通量低、成本高、测序准确度低等缺点在eDNA宏条形码技术的使用中并不多，二代测序（NGS），不仅可以检测到环境中含量非常低的eDNA，而且可在一个样本中同时分析数千个物种。对于NGS得到的大量序列数据我们需通过计算机工具来处理，也就是最后的生物信息学分析，生信分析是研究人员面临的最大困境之一，它要求从事分类学家掌握一定的计算机信息知识，一些图形化界面可能降低了难度，但同时占用了更多的系统资源，也降低了计算机的工作效率。目前已有公司提供eDNA测序服务，如Illumina和国内的上海凌恩生物科技有限公司，他们只需要你提供最初的DNA样本就能帮你完成后续操作，包括生信分析后的数据可视化展示。但价格不菲，多数实验室并没有充足的经费来持续购买公司的服务，毕竟去野外采样等其它方面都需要经费的支持。

        具有非侵入性取样、通量大、省时高效等优势的eDNA宏条形码技术具有广阔的应用前景。特别是在昆虫多样性的调查中，它能在采样和整理样本中节省大量时间，但目前的公共数据库中序列的数量与质量并不能满足我们的需求，我们需要通过传统分类方法来证明eDNA宏条形码技术获得的结果的确是可靠的。

参考文献

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