去泛素化酶USP10调节KLF4稳定性并抑制肺肿瘤发生

写在前面

        今天推荐的是由大连医科大学肿瘤干细胞研究所在2019年12月20日发表于Cell Death & Differentiation（IF：15.828，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Chuanchun Han教授，研究表明去泛素化酶USP10调节KLF4稳定性并抑制肺肿瘤发生。

研究背景

        Krüppel样因子4 (KLF4) 是一种关键的转录因子，是参与多种侵袭性癌症进展的多功能参与者。蛋白酶体依赖性途径是在翻译后水平控制KLF4丰度的主要方式之一。尽管已经鉴定了一些泛素连接酶，但KLF4的去泛素酶和调节功能仍未得到探索。

摘要部分

        在这里，通过筛选可能与KLF4相互作用的泛素特异性蛋白酶，作者发现泛素特异性肽酶 10 (USP10) 作为KLF4的去泛素化酶。USP10的过表达通过阻断KLF4的降解显着增加KLF4蛋白水平，而USP10的敲低促进KLF4降解，从而增强肿瘤发生。小鼠中USP10的缺失会下调KLF4表达并加速KrasG12D驱动的肺腺癌的发生和进展。此外，作者的数据显示，KLF4可以通过直接结合TIMP3启动子来促进肿瘤抑制基因TIMP3的转录。临床上，USP10表达的降低，伴随着癌组织中KLF4和TIMP3丰度的降低，预示着肺癌患者的预后不良。总之，作者的结果表明USP10是KLF4的关键调节因子，将USP10-KLF4-TIMP3轴确定为肺癌有潜力的治疗靶点。

研究内容

1.USP10增强KLF4表达       

        为了筛选可能调节KLF4稳定性的潜在DUB，作者在HEK293T细胞系中与GFP-KLF4一起表达了各种DUB。实验表明，在HEK293T细胞中，USP10的共表达显着增加了KLF4蛋白水平，而非其他USP。为了进一步证实这一点，作者在肺癌细胞中过表达USP10并发现USP10的异位表达导致KLF4升高。相反，USP10的敲低（KD）降低了肺癌细胞和人支气管上皮细胞（HBE）中的KLF4蛋白水平。     

        接下来，作者检查了KLF4蛋白水平的增加是否依赖于USP10的去泛素化酶活性。野生型USP10而非CA突变体增加了KLF4蛋白水平。这些结果也在使用 CRISPR/Cas9 系统建立的USP10敲除 (KO) 肺癌细胞中得到证实。作者发现野生型USP10而非CA突变体的异位表达逆转了USP10KO对KLF4的减少。

        为了进一步研究USP10对体内KLF4表达的影响，引入了Loxp-Cre策略介导的USP10小鼠的全身敲除。与之前的报告一致，Usp10-/-小鼠在出生后一天内死亡。作者解剖并收集了USP10 WT和KO小鼠出生时的各种组织。发现小鼠中USP10的缺失显着降低了肺、肌肉和脾脏组织中KLF4的表达。类似地，在来自USP10 KO小鼠的MEF细胞中，KLF4蛋白水平被下调而mRNA水平不受影响。

研究结论：USP10在体内和体外特异性地增加了KLF4蛋白水平。

 

2.USP10保持KLF4稳定性并去泛素化KLF4     

        为了进一步验证USP10是否以蛋白酶依赖性方式影响KLF4表达，用蛋白酶体抑制剂MG132处理USP10敲低的H1299和A549细胞。研究发现MG132逆转了KLF4的下调。值得注意的是，野生型USP10而不是突变体的过表达可导致内源性KLF4蛋白稳定性的显着增加。相反，USP10敲低导致KLF4蛋白不稳定。

        考虑到USP10可以作为去泛素化酶从其底物中去除泛素化，作者推断USP10应该通过去泛素化来调节KLF4的表达。正如预期的那样，野生型USP10异位表达降低了KLF4的多泛素化，而USP10缺失增加了KLF4多泛素化，这可以通过引入野生型USP10回补。作者进行了体外去泛素化测定，野生型USP10而非CA突变体在体外去除了KLF4上的Ub链。

研究结论：USP10控制KLF4的稳定性并抑制其多泛素化。

 

3.USP10与KLF4相互作用     

        作者接下来确定USP10是否直接与KLF4相互作用。免疫共沉淀测定证实异位表达的 GFP 标记的KLF4可以在FLAG标记的USP10中检测到，反之亦然。此外，纯化的GST-KLF4，能够在体外与带 FLAG 标签的USP10结合，表明USP10和KLF4之间存在直接相互作用。另一方面，在H1299和A549细胞中也检测到内源性USP10和KLF4之间的相互作用。免疫荧光分析显示USP10和KLF4共定位于H1299和A549细胞中。

        KLF4作为多功能转录因子发挥作用，KLF4的羧基末端包含三个锌指和两个核定位信号，可介导DNA结合并调节亚细胞定位。作者在 HEK293T 细胞中表达了带有Flag标签的USP10以及KLF4的不同结构域。免疫共沉淀分析表明KLF4的抑制域对其与USP10的物理相互作用至关重要。不仅如此，USP10的氨基末端区域（aa1-aa100）介导了与KLF4的物理相互作用。USP10的氨基末端缺失突变体失去了对调节KLF4蛋白水平和泛素化的作用。

研究结论：USP10是KLF4真正的相互作用蛋白

 

4.USP10缺失通过下调KLF4促进肺肿瘤发生     

        先前的研究表明KLF4是肺癌中的重要肿瘤抑制因子，因此作者探讨了USP10是否通过调节KLF4来抑制肺肿瘤的形成。为此，作者在有无USP10敲低的H1299和A549细胞中过表达KLF4。沉默USP10表达可以显着增加肺癌细胞的增殖和迁移，并且KLF4表达的恢复完全回补了USP10 KD引起的表型。一致地，异种移植测定表明KLF4的过表达可以逆转USP10缺失的影响并抑制肿瘤的发展和转移。

        为了探究USP10在体内肺肿瘤发生中的生物学作用，作者建立了KrasG12D驱动的肺 ADC模型。通过鼻内滴注将表达AAV-Cre-GFP的腺相关病毒递送至KrasLSL-G12D/WT/USP10WT和KrasLSL-G12D/WT/USP10 KD小鼠以诱导KrasG12D蛋白的表达。作者在AAV-Cre感染后使用微计算机断层扫描对一组成对的KrasG12D/WT/USP10 WT和KrasG12D/WT/USP10 KD小鼠进行成像。通过冠状和横切面成像μCT扫描，KrasG12D/WT/USP10 KD小鼠在肺中显示出比KrasG12D/WT/USP10 WT小鼠更多的可检测结节。随后，作者在AAV-Cre诱导后120天对小鼠进行了肿瘤分析。与 KrasG12D/WT/USP10相比，KrasG12D/WT/USP10 KD小鼠的肿瘤负荷和肿瘤面积显着增加，导致KrasG12D/WT/USP10 KD小鼠的生存期显着缩短和预后不良。此外，作者检测到肺组织中的KLF4表达，发现 KrasG12D/WT小鼠中USP10的消耗显着降低了KLF4蛋白水平并增加了KLF4泛素化。

研究结论：表明USP10通过在体内和体外调节KLF4来抑制肿瘤生长和转移。

 

5.KLF4转录上调TIMP3表达     

        为了剖析USP10对KLF4表达的影响如何抑制肺癌发生和进展的可能分子机制，作者使用RNA-seq鉴定受USP10影响的KLF4下游基因。在通过 CRISPR/Cas9系统对两个基因进行KO后，作者检测差异表达的KLF4 KO和USP10 KO mRNA。毫不奇怪，许多差异表达的基因（58个上调和243个下调）在KLF4 KO和USP10 KO条件下表现出相同表达趋势。此外，作者发现一些已知的肿瘤抑制基因在KLF4 KO和USP10 KO后同时下调。

        有趣的是，通过计算 MSigDB中243个下调基因和基因集之间的重叠，发现TIMP3在许多代表癌症相关生物状态或过程的关键特征中显着富集。在可以归类到肺癌基因集中的那些下调基因中，TIMP3是排名最高的肿瘤抑制基因。随后，分别在KLF4 KO和USP10 KO肺癌细胞中使用q-RT-PCR和western blot进一步验证了TIMP3下调。当内源性KLF4和USP10被两个独立的shRNA敲低时，获得了类似的结果。KLF4过表达逆转了USP10缺失导致的TIMP3减少。相反，当KLF4被敲除时，USP10过表达导致TIMP3的增加被抑制。此外，USP10的缺失也抑制了来自USP10 KO小鼠的肺组织和MEF细胞中TIMP3的表达。

研究结论：TIMP3是USP10-KLF4通路的下游基因。

 

6.USP10和KLF4通过调节TIMP3表达抑制肺癌细胞生长和转移

        为了评估USP10和KLF4是否通过上调TIMP3表达抑制肿瘤发生，作者在KLF4或USP10耗竭-H1299和A549细胞中过表达TIMP3，并观察到TIMP3的异位表达减弱了KLF4或USP10敲低诱导的细胞生长和迁移。一致地，异种移植测定表明TIMP3的过表达可以回补KLF4或USP10丢失的影响并抑制肿瘤发展。

研究结论：USP10和KLF4通过上调TIMP3来抑制肿瘤生长和转移。

 

7.USP10的降低与KLF4和TIMP3的下调呈正相关，并预测肺癌患者的不良预后

        为了评估USP10-KLF4-TIMP3轴的临床重要性并确定它们在肺癌中的相关性，作者进行了免疫组织化学 (IHC) 染色以探究这些蛋白质在肺ADC组织和邻近组织的表达水平。IHC 结果显示，与相邻组织相比，USP10、KLF4和TIMP3的表达水平在肺ADC组织中显着下调。特别是，USP10、KLF4或TIMP3水平相对较低的肺肿瘤患者的总生存期比这些蛋白质水平高的患者短。此外，数据表明，这些肿瘤样本表现出USP10、KLF4和TIMP3蛋白表达水平之间的正相关。通过分析从TCGA和GEO数据库获得的两组肺癌患者的RNA-seq数据，进一步证实了上述发现。作者证实肺肿瘤组织中KLF4和TIMP3的 mRNA 水平低于正常组织，并且KLF4也与TIMP3表达水平呈正相关。

研究结论：USP10的降低与KLF4和TIMP3的下调呈正相关，并预测肺癌患者的不良预后。

 

结论与讨论

        总之，作者的研究为KLF4在肺癌中的调控机制提供了新的见解，并揭示了USP10是KLF4去多聚泛素化的新型DUB。功能研究表明, USP10表达的缺失促进了体外和体内肺肿瘤的发生。此外，这一研究进一步证实了TIMP3是肺癌中KLF4的下游靶基因。总之，结果表明USP10是KLF4的重要调节因子，并且USP10-KLF4-TIMP3信号轴在肺癌抑制中起着关键作用。

 

Thank you!

 

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41418-019-0458-7