宿主诱导的基因沉默：一种针对镰刀菌的有效控制策略

镰刀菌属Pezizomycotina由大约 300 个物种组成。某些物种，如禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、增殖镰刀菌、茄病镰刀菌和轮枝镰刀菌是植物病原菌，可引起枯萎病或枯萎病。镰刀菌产生霉菌毒素，对小麦、大麦和玉米具有特别的意义。对抗这些病原体的最新和有效的控制策略之一是基于通过宿主诱导的基因沉默（HIGS）对关键基因进行沉默。最近，一些研究人员成功地沉默了F. graminearum、F. oxysporum、F.culmorum和F. verticillioides中编码细胞色素P450、几丁质合成酶、蛋白激酶等的重要基因，导致霉菌毒素产量减少。这篇综述中，我们将介绍表明HIGS是控制植物中镰刀菌属感染的有力工具的报告。RNAi（RNA干扰）是指可以在转录和转录后水平介导基因沉默的生物过程。事实上，RNAi机制是植物对抗病毒病原体、真菌、细菌、害虫和寄生线虫的重要过程。在F. oxysporum、F. graminearum和F.culmorum中，通过双链RNA（dsRNA）靶向真菌基因可导致真菌生长迟缓，和/或毒力下降，导致植物疾病症状减弱或病原体死亡。

HIGS对抗F.graminearum

禾谷镰刀菌在重要的谷类作物如小麦、玉米、大麦、黑麦、燕麦和三叶草中引起镰刀菌头斑病（FHB），会导致产量和谷物质量大幅下降。此外，该病原体在谷物中产生霉菌毒素，对动物和人类有害。FHB主要是由F. graminearum引起的，其次是由F. culmorum、F.avenaceum、F. pseudograminearum、F. poae，有时由Microdochium引起，如M. nivale。在被感染的植物组织中，F. graminearum产生三叶草毒素、DON以及衍生物、3-ADON、15-ADON（3-乙酰基DON和15-乙酰基DON）和nivalenol。一些国家已经规定了谷物中镰刀菌毒素的最大允许含量。由于目前的杀真菌剂效力有限，而且小麦和大麦缺乏主要的抗性基因，FHB的发生率正在增加。已经探索了一些非常规的方法，使用先进的生物技术来对抗FHB并尽量减少霉菌毒素的产生。其中，植物介导的FHB遗传抗性是最有价值和成本效益的抗病策略。然而，最近的方法，如HIGS和SIGS，已经成功地导致了基本真菌基因的沉默. 例如，F. graminearum被HIGS控制，通过靶向真菌细胞色素P450 lanosterolC-14α-demethylase（CYP51）基因，这是麦角甾醇生物合成的必要基因，以限制真菌感染。F. graminicola的基因组中含有禾本科植物的基因组中含有三个真菌CYP51基因，即CYP51、CYP51A、CYP51B和CYP51C。在这个实验中，用CYP3RNA（一种791 bp的dsRNA构建体，在体外条件下靶向CYP51A、CYP51B和CYP51C转录本）培养F. graminearum，导致生长受限，真菌形态改变，降低毒力（表1）。

此外，He等人（2019年）构建了携带RNAi盒的转基因Brachypodium distachyon品系，以针对两个F. graminearum蛋白激酶基因Fg00677和Fg08731，以及CYP51编码基因CYP51A，CYP51B，和CYP51C。所有相应的独立、Fg00677-RNAi、Fg08731-RNAi和CYP51-RNAi转基因T2株系对F. graminearum表现出很强的抗性。结果表明，Fg00677和Fg08731是HIGS的有效靶标，可以应用于构建转基因HIGS植物，以增强FHB的抗性。

植物病原真菌拥有多个几丁质合成酶（CHS）编码基因，这些基因在真菌的发育和毒力方面起着关键作用。CHS基因也可以作为RNA沉默的靶基因来对抗镰刀菌感染。Cheng等人（2015）采用HIGS靶向CHS基因，生产了转基因小麦植株，以增强对镰刀菌病原体的抵抗力，减少霉菌毒素。这些转基因植物表达了对F. graminearum的ChS3b基因有效的3种RNAi构建体，对FHB和Fusarium苗期枯萎病（FSB）表现出持久和一致的抗性。这些结果证明了HIGS作为一种有效的策略在作物中产生环境友好和持久抗性的潜在效用。

HIGS对抗F. oxysporum 

       F. oxysporum属镰刀菌属，在土壤中无处不在。一个多世纪以来，这种病原体受到了极大的关注。F. oxysporum中独特的formae speciales可以在150多个宿主中引起维管束枯萎病。农艺实践只能减少接种体的传播，不能导致令人满意的疾病控制效果。同样地，土壤熏蒸和杀真菌剂的应用都无法形成有效的疾病保护。有趣的是，Mumbanza et al.(2013)使用了一套合成的dsRNAs来对付引起香蕉镰刀菌枯萎病的一些致病性镰刀菌菌株，并证明了对香蕉镰刀菌的强抗真菌活性。Ghag等人（2014）通过RNAi靶向Foc的重要基因，如velvet 和ftf1，以减少香蕉（Musa spp.）的镰刀菌枯萎病。用这两个基因的部分序列转化的转基因香蕉在温室条件下缺乏镰刀菌枯萎病，即使在接种后8个月，对Foc的抗性也很明显（表1）。在随后的报告中（Hu等人，2015），HIGS被用来沉默F. oxysporum f. sp. Conglutinans中的三个基因，FOW2、FRP1和OPR。接种到转基因拟南芥品系上的F. oxysporum表现出三个目标基因的mRNA水平大幅下降（平均75%、83%和72%）。所有转基因品系对F. oxysporum表现出更高的抗性（表1）。Shanmugam等人（2017）报道了RNAi介导的致病性基因FOW2的沉默，一个ZnII 2Cys6型转录调节器FOW2和V类CHS。通过RNAi证明了这两个基因在F. oxysporum和F. solani的致病性中的作用。值得注意的是，HIGS介导的FOW2和ChSV的沉默导致转基因番茄对高毒力的维管束萎缩真菌菌株的抗性增强. 使用靶向SGE1的dsRNA构建体沉默了Foc引起香蕉巴拿马病的这个基因。孢子的明显减少（约95%）表明，SGE1可能是香蕉植物HIGS的一个有希望的候选者。Pareek和Rajam（2017）制作了RNAi菌株的F.oxysporum靶向MAP激酶信号基因Fmk1、Hog1和Pbs2。RNAi菌株对番茄的毒力降低。此外，RNAi介导的FoPEX6的沉默，减少了孢子的产生，导致番茄上的毒力急剧下降。

同样，Dou等人（2020年）采用HIGS靶向ERG6/ERG11（麦角甾醇生物合成）基因，产生了抗Foc的转基因ERG6-RNAi和ERG11-RNAi香蕉植物。Pérez等人（2020）在转基因大豆品系中表达了对应于F. oxysporum的CYP51B基因的siRNA。与非转基因对照植物相比，转基因大豆植物显示出对F. oxysporum的抗性，表现为更好的芽和根生长（表1）。最近，Singh等人（2020年）通过HIGS靶向鸟氨酸脱羧酶（ODC），这是F. oxysporum f. sp. lycopersici的一个重要的多胺生物合成基因。多胺如亚精胺、腐胺和精胺对该真菌的正常生长和发育非常重要。表达的siRNA表现出轻度到高度的抗性在转基因番茄品系中对镰刀菌枯萎病的影响。最近，Tetorya和Rajam（2018，2021）探索了RNAi介导的编码过氧化物酶体生物生成因子和β-1,3葡聚糖转移酶的基因沉默的潜力，以赋予转基因番茄植物对镰刀菌枯萎病的抗性。这些基因的片段被用来生成发夹式RNAi构建体，利用农杆菌介导的转化，将其转化为番茄。表达这些构建体的转基因品系显示出对Fol的抗性增强，这体现在疾病症状的发展延迟。

其他镰刀菌物种中的HIGS

除了F. graminearum和F. oxysporum之外，HIGS也被应用于其他镰刀菌物种。F. verticillioides是毒性真菌之一，在玉米（Zea mays）穗中产生伏马菌素作为一种霉菌毒素。由于轮枝菌是一种种子传播的病原体，因此难以控制，基于RNAi的新策略可能旨在减少伏马菌素的污染。Johnson等人（2018年）产生了含有伏马菌素生物合成基因FUM1和FUM8的RNAi构建的伏马菌素转化体。由此产生的几个转化体表现出FUM1基因的表达减少，而且值得注意的是，伏马菌素B1的含量减少了3675倍。减少FUM8的表达导致伏马菌素B1的含量减少2240倍。这些结果表明，可以采用HIGS来沉默玉米中的FUM1或FUM8基因，并减少伏马菌素的污染。Chen等人（2016年）在F. culmorum中应用HIGS来沉默目标基因FcGls1或沉默三个目标基因，即FcGls1、MAP激酶FcFmk1和几丁质合成酶FcChsV。所有用针对上述基因的RNAi构建体转化的转基因小麦植株在温室和近地条件下都表现出对FHB的抗性增强（表1）。

结论和未来前景

沉默真菌病原体的基本基因，如F. graminearum, F. oxysporum, F. solani, F.verticillioides 和 F. proliferatum，可以赋予疾病抵抗力并减少霉菌毒素的产生。除了HIGS作为赋予长效保护的宝贵工具外，siRNA也可以作为外用制剂，以避免与植物转化相关的困难。HIGS与其他生物技术工具相结合，如基因组编辑，特别是与簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白9（Cas9）相结合，可以成功地应用于改善对真菌性植物疾病的控制。

原文链接：

https://doi.org/10.1007/s41348-022-00613-8