Nat Neurosci：星形胶质细胞分化调控的关键
胶质细胞在中枢神经系统发育中至关重要。近日， Paul W. Frazel和Shane A. Liddelow等团队利用scRNA-seq/snRNA-seq技术研究小鼠和人类细胞，鉴定潜在关键基因，简化星形胶质细胞differentiation protocols，揭示基因组调控位点，为未来胶质细胞研究提供指导。
他们的成果发表在近期的Nature Neuroscience杂志上，名为 “Longitudinal scRNA-seq analysis in mouse and human informs optimization of rapid mouse astrocyte differentiation protocols”
通过单细胞RNA测序，作者研究了小鼠和人类星形胶质细胞的发育中间阶段，发现关键调控基因。此外，它们缩短了小鼠星形胶质细胞分化方案，比较了不同影响因素对基因表达的影响。他们还使用多组学测序深入研究非编码基因组区域，揭示神经胶质细胞命运（glial fate）的关键联系。这些发现有望促进多种神经系统疾病的研究。
1. 体外人类星形胶质细胞分化分析
作者使用了无血清分化方案，生成混合培养，包括星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞谱系细胞，以模仿神经和神经胶质细胞一起生长的更自然环境。作者在第30天和第50天分别采集了样本，对应于神经生成完成和胶质生成开始，然后进行了scRNA-seq分析（图1）。结果显示，体外分化对研究胶质生成非常有效。通过基因表达和免疫染色，作者确认了成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞簇（图1）。
进一步分析表明早期神经/星细胞祖细胞与可能成为少突胶质细胞的前体细胞不同。另外，作者观察到一些细胞可能同时形成星形胶质细胞和少突胶质细胞，代表了早期致力于胶质形成的细胞。
最后，作者发现了四个稳定的宏观状态，包括两个成熟星形胶质细胞簇、神经元和少突细胞。这些发现有助于深入了解胶质细胞发育过程中的不同阶段。
图1. 人类胶质分化的scRNA-seq揭示了谱系特异性前体和瞬态
2. 与命运决策（fate decisions）相关的基因鉴定
为深入研究胶质细胞发育的中间过程，作者寻找了与特定宏观状态的命运高度相关的基因（图1h-j）。数据表明，细胞类型的分化顺序与大脑发育一致。神经元分化概率随时间下降，而星形胶质细胞和少突胶质细胞分化概率相反。高表达DCX基因的细胞更有可能成为神经元。他们还发现与神经元分化高度相关的基因，包括STMN2、DCX、ELAVL4和ELAVL2。
在星形胶质细胞中，TTYH1与分化概率最相关，尽管此前未与星形胶质细胞分化有关。SPARC和SPARCL1的表达也与星形胶质细胞命运高度相关。对于少突胶质细胞，UGT8和MBP与分化概率最相关。
3. 小鼠星形胶质细胞分化方案的优化
作者优化小鼠星形胶质细胞与小鼠胚胎干细胞的分化。最近的研究表明小鼠星形胶质细胞分化方案无法产生成熟星形胶质细胞，与人类分化方案形成鲜明对比。在缺乏神经元发育信号的情况下，星形细胞存在不成熟情况，强调了混合细胞培养的优势，并更加强调了了解细胞命运决定的必要性。
作者修改了无血清分化方案，旨在生成中枢神经系统星形胶质细胞。修改包括去除CNTF生长因子、使用聚-D-赖氨酸和层粘蛋白涂抹板、去除维甲酸和平滑激动剂（图2）。通过刺激细胞并测量Gfap表达，他们证实了修改后的分化方案可在较短时间内产生GFAP高水平的星形胶质细胞。
图2.小鼠胶质分化的scRNA-seq揭示了谱系特异性前体和瞬态
4. 小鼠星形胶质细胞分化的早期阶段
为深入了解早期星形细胞发育，作者采用scRNA-seq分析了前12个分化日的基因表达。RNA速度分析显示从mESC和EB到中间阶段的速度流动（图2d）。采用WOT算法，他们识别了神经元宏观状态和非神经元宏观状态（图2e）。
此后，他们计算了进入这两个状态的细胞概率，发现大多数细胞进入非神经元状态（图2g）。研究随时间变化的概率对数几率发现，随着时间推移，进入神经元状态的概率下降，与神经基因表达下降一致。Dcx是与神经元状态相关的关键基因之一。最后，作者研究了在FGF1/BMP4处理下基因表达的变化。集群1表达了与星形胶质细胞发育相关的基因，包括Slc1a3和细胞周期基因，而集群0表达与TGF-β信号相关的基因。这些结果有助于深入了解早期星形细胞发育的关键过程（图3）。
图3.分析早期小鼠星形胶质细胞分化的子集
5. 星形胶质细胞分化方案的多组学分析
作者比较CNTF和BMP4/FGF1引起的基因表达变化。进行了多组学分析，包括snATAC-seq和snRNA-seq。他们确定了与命运获取相关的基因，还比较了最终时间点之间的基因表达差异，发现CNTF条件的顶级标记基因是S100a6，标志着星形胶质细胞亚型。他们分析snATAC-seq数据（图4），确定在一个生长因子条件下与另一个条件下富集的峰值。进行TF基序分析，作者发现在CNTF条件下与Smad家族TFs相关的富集模式，与之前的研究一致。作者还检查了CNTF的S100a6和BMP4/FGF1的Fabp7两个位点的染色质可及性，发现存在明显差异。
图4. 对两个不同的星形胶质细胞分化时间序列的多组学分析
总结
本研究使用sc/snRNA-seq数据分析小鼠和人类胶质细胞分化，提出了分化方案假设，为未来谱系追踪实验提供指导，同时发现了潜在的胶质谱系前体和神经发育关键基因。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41593-023-01424-2
参考文献
Frazel PW, Labib D, Fisher T, et al. Longitudinal scRNA-seq analysis in mouse and human informs optimization of rapid mouse astrocyte differentiation protocols. Nat Neurosci. 2023;26(10):1726-1738. doi:10.1038/s41593-023-01424-2
编译作者：Ayden（brainnews创作团队）
校审：Simon（brainnews编辑部）
