基于 RNAi的农药和抗病毒剂：

用于农业和水产养殖的dsRNA 微生物过量生产系统 

随着全球人口增加和生活水平的提高，生产丰富、优质、安全的食品变得越来越重要。然而，害虫和病原体对农业和水产养殖业构成严重威胁。通过化学农药保护农产品免受农作物害虫的侵害，在保障粮食资源方面发挥了核心作用。然而，许多常规化学农药的各种缺点已经变得明显。例如，由于它们的广谱作用，它们对传粉媒介和掠食性瓢虫等有益昆虫产生负面影响，这对生物多样性构成了挑战。一般来说，合成化学农药在自然环境中的分解速度较慢，因此存在化学农药残留对生态系统健康的担忧。长期大量使用化学杀虫剂，导致害虫对化学农药产生耐药性。此外，合成化学农药已被广泛研究和商业化，因此，开发具有新化学结构的创新合成农药不再像过去那样容易。此外，在水产养殖中，尤其是对虾养殖中，人们担心使用大量化学抗生素和合成抗病毒剂会导致产生耐药病原体的生态影响，因此需要开发更加自然和环保的产品。友好的疾病控制剂是令人垂涎的。针对这种情况，欧盟（EU）2020年报告《从农场到餐桌的战略》呼吁将化学农药的总体使用和风险减半，畜禽和水产养殖中抗生素的使用2030。最有希望的替代品之一是基于 RNAi 的杀虫剂和 RNAi 试剂。 这种基于 RNAi 的产品的功能成分是具有双链结构的 RNA 分子 (dsRNA)。其作用基于 RNA 干扰 (RNAi) 机制，当 dsRNA 被吸收到具有 RNAi 能力的细胞中时，RNAi 以核苷酸序列特异性方式特异性抑制靶基因的表达（图 1 ）。换言之，基于 RNAi 的农药通过 RNAi 效应抑制对目标作物害虫生存至关重要的基因的表达，从而抑制害虫的生命，甚至导致死亡。因此，此类农药也被称为“RNA诱导的基因沉默农药”。

基于 RNAi 的农药和抗病毒剂的应用大致可分为两类：建立表达作用于目标害虫的 dsRNA 的转基因植物，以及将 dsRNA 外源（局部）应用于植物体（例如，通过叶面喷施）喷雾、灌溉或树干注射）。前者是一种利用转基因作物进行害虫管理的方法，后者是一种非转化的 dsRNA 传递。本综述的重点是生产用于局部给药的 dsRNA，特别是用于作物叶面喷洒。另外，还讨论了可应用于养虾饲料的 dsRNAs 形式的生产。

使用基于 RNAi 的杀虫剂作为杀虫剂的第一个优点是它们基本上只抑制目标害虫的生长。由于设计了特异性抑制要杀死或抑制的害虫中靶基因表达的核苷酸序列，因此基于RNAi的农药不应影响非预期（非靶）昆虫；这种方法有利于生态系统的生物多样性。第二个优势是作为杀虫剂的有效因子的 RNA，由于其固有的化学不稳定性和核酸酶在生物生态群落中的普遍存在而在环境中相当快地降解。同样，基于 RNAi 的杀虫剂的这一特性与生态系统保护基本一致。然而，适度控制可降解性是 dsRNA 在局部施用于农作物的杀虫剂中实际应用的一个重要方面。基于 RNAi 的杀虫剂的第三个有价值的特征是它们的应用允许对新出现的害虫疾病和对已经使用的杀虫剂产生抗药性的害虫做出灵活和快速的反应。即使目标害虫对所使用的基于 RNAi 的农药产生抗药性，原则上可以通过简单地靶向同一基因的另一个区域或通过改变害虫中的目标基因来快速开发一种新的基于 RNAi 的农药 .然而，在这方面，由于涉及 RNAi 作用的潜在机制的基因突变，最近报道了一种强大的抗性害虫的出现；这将在下面具体讨论。

评估这些创新的基于 RNAi 的杀虫剂和抗病毒剂的实际应用对人类健康和生态系统的影响仍然至关重要（就像使用传统杀虫剂一样）。然而，该技术开发和应用的直接实际问题是：（i）需要大幅降低生产成本； (ii) 改进对作物害虫等目标生物体的施用方法（这也与产品成本问题有关），以及 (iii) 选择不会导致脱靶效应的 RNA 序列，即不发挥作用的 RNA 序列在目标害虫的特定基因以外的基因上。最紧迫的挑战是将 dsRNA 生产成本降低到可以将基于 RNAi 的产品投入实际商业应用的水平。用于农田和水产养殖池塘所需的 RNA 量是巨大的，因此，必须找到以经济可行的方式生产大量 dsRNA（设计的核苷酸序列为几百个碱基对）的方法。  

这篇综述概述了最近使用代表性微生物大肠杆菌、丁香假单胞菌、谷氨酸棒状杆菌和莱茵衣藻作为宿主菌株生产 dsRNA（包括发夹型 RNA 物种，hpRNA）的方法，如以及使用其他一些微生物的研究结果。在大肠杆菌中，有许多关于使用大肠杆菌噬菌体 T7 转录系统生产具有部分双链结构的 hpRNA 和 dsRNA 的报道。已开发出一种结合丁香假单胞菌及其噬菌体 phi6 的独特系统，以提高 dsRNA 产物的稳定性。最近使用工业微生物谷氨酸棒杆菌建立了一个高水平的 dsRNA 生产系统，谷氨酸棒杆菌是一种“公认安全”（GRAS）菌株。使用光合微藻 Chl 生产 dsRNA 的研究结果。 reinhardtii 已被报道，特别是在水产养殖业中的应用。除了这些生物之外，最近报道了使用各种酵母、乳酸菌和共生微生物生产 dsRNA 的研究案例，用于害虫防治。

随着制造技术的改进，RNA 的生产成本逐年下降。一家名为 RNAgri（前身为 APSE）的生物技术公司开发了一种技术，可以以 1-2 美元/g RNA 的成本生产 dsRNA。他们的生产系统声称基于大肠杆菌中病毒样颗粒 (VLP) 中目标 dsRNA 的积累。噬菌体 MS2 的外壳蛋白 (CP) 和含有包装位点 (PSs) 的目标 dsRNA 的前体同时表达。 CP 和 PS 将 RNA 结合并封装在 VLP中。 GreenLight Biosciences 用于生物分子合成的无细胞系统中的 RNA 生产也引起了人们的关注。一般来说，无细胞系统中 RNA 生产的主要障碍是作为 RNA 构建块的四种核糖核苷三磷酸 (NTP) 的高成本。该公司通过使用核酸酶将源自酵母生物质的核酸降解为构成单体，从而实现了目标 RNA 的低成本生产。

本综述中描述的 dsRNAs 的微生物生产方法可用于从可持续原材料中大规模生产目标 dsRNAs。总结了一些描述目标 dsRNA 生产力的代表性研究。所采用的方法必须针对特定需求进行调整；有必要根据其用途和实际要求为每种基于 RNAi 的产品建立优化的生产方法。诸如使用生产微生物作为胶囊以保护目标 dsRNA 免受意外降解，或使用微生物本身作为水产养殖的补充营养物等方面，可能会增加基于 RNAi 的试剂的价值。基于 RNAi 的产品有助于解决现在和未来与安全可靠的农产品生产相关的各种问题；换言之，实现“可持续农业”。基于 RNAi 的杀虫剂将有助于保护和维持自然生态系统，并将极大地帮助建立“可持续农业”。同样，在水产养殖中，dsRNA 物种的抗病毒作用将减少化学抗病毒药物的广泛使用，这些药物具有广泛的活性，有助于建立“可持续水产养殖”。    

本综述主要总结了基于 RNAi 的产品实际应用的第一个技术障碍。但是，还必须考虑更广泛的问题。为了实现基于 RNAi 的产品的好处，农产品消费者、基于 RNAi 的产品用户（农民）和 RNA 农药生产者之间的沟通对于确保基于基于 RNAi 的产品的科学证据。然后，需要适当的管理、监督和立法，基于 RNAi 的产品必须经过适当的安全评估和批准程序。喷雾或外用 dsRNA 杀虫剂正在开发中，但目前还没有专门针对此类基于 RNAi 的杀虫剂的法律法规。欧盟或美国没有具体的指导文件来定义批准基于 dsRNA 的农药的数据要求。经济合作与发展组织 (OECD)已就这一问题提出了第一次审查和建议。       

一旦可以采购到低成本的 dsRNA，各种基于 RNAi 的产品不仅可以实际应用于农业和水产养殖，还可以用于防治蟑螂、火蚁、白蚁和传染病媒介等卫生害虫. 通过这种方式，可持续的基于 RNAi 的产品有望对人类的生活产生有益的影响。气候变化将促进令人生畏的农作物害虫的传播和传播。可以应对农作物害虫引起的潜在粮食危机的环保害虫防治方法极为重要，基于 RNAi 的产品有望在应对这一挑战中发挥关键作用。

原文链接：

https://doi.org/10.3390/app12062954