质粒DNA转染小技巧

1⃣️细胞准备
转染前一天，取出处于对数生长期的健康细胞，吸掉原来的培养液，用无菌 PBS 清洗细胞。加入 1 mL胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入终止液终止消化。采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打， 后上下吹打的方式。收集细胞悬液于 15 mL离心管中，每分钟 800 转，室温离心 5min。用罗氏 CASY 快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。弃去上清，加入培养基重悬细胞。 以每孔 3-5×105 细胞密度接种到 6 孔培养板上，在无抗生素培养基中培养一天。🌸具体数量因细胞种类不同而不同，掌握为转染时使细胞达到 80%~90%的融合率。转染前 3 h,取出无抗生素培养的细胞置于倒置显微镜下观察。若融合率达 80%~90%，即可进行转染实验🪐
2⃣️耗材及试剂准备
实验开始前，准备好所需的 Optimem I 无血清培养基，去核酸酶 EP 管，经高压灭菌的200 uL和 1 mL枪头各一盒枪头，罗氏 X-tremeGENE HP DNA 转染试剂🌛
3⃣️细胞转染
🧑‍🎓首先进行转染试剂复合物的制备。在已标记好的 EP 管中分别加入 100uL Optimem I 无血清培养基采用 1 if 质粒:100 uLOptimemI 稀释质粒 DNA。枪头轻轻吹打混匀🎁
将 3 μL转染试剂缓缓加入上述稀释好的 100 uL质粒 DNA 中，即 X-tremeGENE HP DNA 转染试剂与 DNA 质粒的比例是 3 uL比 1 μg。最小体积为 100μL，减少复合物体积将会 显著降低转染效率. 转染试剂与 DNA 的最优比例，以及复合物的最适总体积，应根据细胞系、细胞密度、检测时细胞生长状况和基因表达的不同进行调整。
在 15 至 25 度条件下，静置转染试剂-DNA 质粒复合物 EP 管，15-20min。取出准备好的待转染细胞，做好相应标记，将转染复合物均匀滴入细胞6孔板中。轻轻摇动培养皿，使转染复合物与细胞充分接触。将培养板放于 37 °C、体积分数为 5%的 CO2 饱和湿度培养箱中培养。