3.2 胞内ROS的合成机制
胞内ROS作为反应副产物生成的途径多种多样，不同细胞器中形成的机制存在区别(图3.1)：
线粒体中，超氧化物被认为是由电子传递链的复合物I和复合物III大量产生的（图3.1b）(Holmstrom and Finkel 2014; Reczek and Chandel 2015)；
内质网(ER)中，构成蛋白质二硫键的半胱氨酸残基的氧化也会产生ROS(Zito 2015)（图3.1c）；此外蛋白质二硫键异构酶(PDI)氧化蛋白质产生的电子传递到内质网氧化还原蛋白1(ERO1)后，也能还原O2产生过氧化氢；对于浆细胞而言，免疫球蛋白的生物合成过程中内质网内会堆积大量的ROS；
过氧化物酶体中，当脂肪酸和其他各种物质，如D-氨基酸、多胺和乙醇酸被FAD或FMN依赖的酶（例如酰基CoA氧化酶）氧化时，就会产生ROS（图3.1d）(Lismont et al. 2019)，甚至生成过氧化氢；
最后，ROS还是各种胞质酶的副产物，如黄嘌呤氧化酶、环氧合酶、细胞色素P450酶和脂氧合酶等(Holmstrom and Finkel 2014)。
图3.1 ROS的合成机制。(a)位于质膜或内体膜上的NOX利用细胞质中的NADPH产生电子(e−)，并跨膜传递。电子与分子氧发生反应生成超氧化物(O2-−)，并由胞膜上或胞外的超氧化物歧化酶(SOD3)将其转化为过氧化氢。H2O2通过水通道蛋白(AQP)转运回胞浆，同时质子泵HVCN1输出NOX产生的H+，重新平衡整个膜电荷水平，维持最佳的NOX活性。(b)线粒体内，超氧化物是由呼吸链的复合体I/III产生。随后在基质中被SOD2转化为H2O2，或在膜间隙中被SOD1转化。基质中的H2O2通过水通道蛋白转移到膜间隙，而膜间隙中的H2O2通过电压依赖性阴离子通道(VDAC)转移到胞浆中。线粒体中的谷氧还蛋白(GPX)和过氧化还蛋白(PRDX)可清除过氧化氢。(c)内质网(ER)中，氧化分泌蛋白和膜蛋白的半胱氨酸，产生二硫键。再经蛋白质二硫键异构酶(PDI)氧化，附带生成的电子被传递给内质网氧化还原蛋白1(ERO1)，还原O2产生过氧化氢，继而通过水通道蛋白转移到细胞质中。最终，过氧化氢被GPX和PRDX还原为水。(d)过氧化酶体内，当脂肪酸和其他物质，如氨基酸、多胺和乙醇酸被依赖于黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黄素单核苷酸(FMN)的氧化酶(如酰辅酶A氧化酶)氧化时，就会产生过氧化氢，随后被过氧化氢通道蛋白/水通道蛋白运输到胞质或被过氧化氢酶清除。
与其他作为副产物产生ROS的分子机制不同，NADPH氧化酶(NOXes)利用电子转移到氧分子来催化ROS的合成（图3.1a）。NOXes本质为膜结合酶家族，涵括7个亚型，即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2(Bedard and Krause 2007; Brandes et al. 2014)。其中，啮齿动物缺乏NOX5。大多数NOXes催化活性的行使都需借助与跨膜分子和胞质分子等的结合，以形成催化核心。例如NOX1-4与Cyba基因编码的跨膜分子p22phox相互作用，而DUOX1和DUOX2分别与跨膜分子DUOXA1和DUOXA2相互作用。此外，NOX5、DUOX1和DUOX2含有EF hand结构，可被钙离子激活。而NOX1-3的胞质亚基与Rac一起共募集而被激活。其中NOX1和NOX3的胞质亚基为NOXA1和NOXO1，NOX2的胞质亚基为p40phox、p47phox和p67phox。募集过程由PKC介导的p47phox和NOXO1的磷酸化触发。Rac的激活也参与了NOX1-3的激活。值得注意的是，不同NOX亚型表现出不同的组织分布和细胞内定位，例如NOX2在巨噬细胞、中性粒细胞和B细胞中大量表达，空间上则分布于质膜和内体中，参与ROS的产生与内体中病原物质的清除。
各种途径产生的超氧化物superoxide被超氧化物歧化酶(SOD)转变为过氧化氢和氧分子(Holmstrom and Finkel 2014; Schieber and Chandel 2014; Reczek and Chandel 2015; Di Marzo et al. 2018)。线粒体中产生的超氧化物被线粒体基质中的SOD2迅速转化为过氧化氢(图3.1b)；不同NOXes异构体的产物也不同，NOX4、DUOX1和DUOX2主要生成过氧化氢，而其他亚型则产生超氧化物。
定位在质膜的NOXes将电子从胞质NADPH转移到膜上，并有能力将合成的超氧化物和过氧化氢输注到细胞外的环境中，而分布于质膜和细胞外的SOD3则能将超氧化物转化为过氧化氢(Di Marzo et al. 2018)（图3.1a）。H2O2输注过程涉及水通道蛋白：线粒体基质中产生的过氧化氢通过水通道蛋白转移到膜间隙(Yoboue et al. 2018)，继而通过电压依赖的阴离子通道(VDAC)转移到细胞质中(Lustgarten et al. 2012)（图3.1b）；过氧化物酶体中产生的过氧化氢通过位于细胞器内过氧化物素和水通道蛋白穿过过氧化物体膜(Lismont et al. 2019)(图3.1d)，受益于H2O2相对稳定的特性（淋巴细胞中H2O2的半衰期为1 ms，而超氧化物O2-的半衰期仅1 μs），之后能以扩散的形式通过水通道蛋白，从而作为信号分子发挥作用。
胞内ROS水平受到抗氧化酶的严格调控，如谷胱甘肽过氧化物酶GPXs、过氧化还原酶(PRDXs)和过氧化氢酶catalase等(Reczek and Chandel 2015)，能催化过氧化氢还原成水。其中，过氧化氢酶主要位于过氧化物酶体中（图3.1d）(Lismont et al. 2019，而GPX和PRDX根据亚型分布在不同的细胞器中：GPX1、GpX4、PRDX3和PRDX5多位于线粒体(Quijano et al. 2016)（图3.1b），GPX7、GPX8和PRDX4多定位在ER中（图3.1c）(Zito 2015)。尽管过氧化物酶体、内质网和线粒体不断产生副产物ROS，但这些细胞器中的抗氧化酶能有效使之清除，从而保护细胞免受氧化应激的损伤。
SuppInfo:
AQP: aquaporin
ERO1: endoplasmic reticulum oxireductin 1
FAD: flavin adenine dinucleotide
FMN: flavin mononucleotide
GPX: glutathione peroxidase
NOXes: NADPH oxidases
PDI: protein disulfide isomerase
PRDX: peroxiredoxin
SOD: superoxide dismutase
VDAC: voltage-dependent anion channel
