P2 DNA分子的双螺旋结构

生命中国的叨叨

与碱基相连的是1号C 与磷酸相连的是5号C

磷酸二酯键——维系DNA一级结构

共价键：共用最外层电子

脱氧核苷酸是DNA的基本单位

Chargaff定则

衍射图片

Steve Bell（not）

视频见BV13x411U71C

DNA：双链

双链DNA最常见形式——B型DNA

DNA每一条链称为多核苷酸连，这条链由许多个单核苷酸单元构成

核苷酸单元：

一分子五碳糖 一分子磷酸基团 ATCG四种碱基其一构成

A腺嘌呤 G鸟嘌呤 T胸腺嘧啶 C胞嘧啶

碳基与1位碳原子相连

一个糖的5号碳与另一个糖的3号碳之间有个磷酸

糖的二号位碳原子少了个羟基 所以叫脱氧核糖

所以DNA中的核苷酸称为脱氧核苷酸

脱氧核苷酸通过磷酸二酯键在DNA链中彼此相连

核苷酸的磷酸基团连接邻位核苷酸的3'位氧原子

5'→3' & 3'→5'

脱氧核苷酸通过共价键形成骨架

DNA的两条链通过碱基之间的氢键互相结合

螺旋的每一圈大约包含10个碱基对

除了碱基间的氢键 碱基堆积也能稳定双螺旋

碱基中相邻的芳香环相互叠加 共享电子云 形成π-π键

双螺旋结构上的规律性形成两部分重复交替的空间叫做大沟和小沟

这些沟扮演了碱基识别与蛋白结合的位点

大沟包含特异性碱基对 小沟包含非特异性碱基对

原因：能与蛋白质互相结合的氢键受体与供体存在于沟内

所以DNA可以看做特异性或非特异性序列 从而使蛋白质能够正确结合在相应基因上 发挥作用

P3 DNA复制的基本特性

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高速性：1000个碱基对每秒

完备性：每个碱基都会复制到（除端粒）

准确性：100亿个碱基对错一个 大多数错误是非编码区的错

• 端粒：

端粒是位于染色体末端的重复的非编码DNA序列 和蛋白质的复合物

• 功能：

保护染色体的末端 防止染色体相互结合 以及免受 核酸酶的降解

• 染色体复制端粒不复制 所以它会不断变短
• 端粒酶用来修复端粒酶的缩短

分裂旺盛的细胞里端粒酶活性高 如生殖细胞、干细胞、癌细胞

Steve Bell

DNA复制的根本原因是细胞要复制的基因组

基因组包含细胞各项功能的蓝本

DNA复制的特点:

1.快

每秒能够合成100-1000个碱基对（bp/sec）

2.完备

基本上 除了极个别的情况 基因组中每一个碱基对都会被复制（端粒有些碱基对不被复制）

3.精确

通常而言 每合成100亿（10的10次方）个碱基对会出现1次错误

人有30亿个碱基对 大概每分裂3次出一次错误 不过100亿个碱基对大部分没有编码功能 错不错无所谓

BUT

如果错误发生在编码区中间 这会改变编码处的氨基酸和蛋白质 这就是一个问题了

一个细胞里DNA的长度大约有2m 全是大约9千万英里 足够你去太阳了 这一生你大概合成1ly的DNA

复制经常作为药物靶点 大部分一线化疗药物都是以复制为靶点

P4 DNA复制的化学基础

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DNA合成需要引物 这是DNA聚合酶的性质决定的

聚合酶不能从头合成DNA 它只能延伸 所以必须需要引物

引物在体内 是由引物酶合成的一段RNA 最短大约能到两个核苷酸

由引物3'羟基 亲核进攻dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）中的二法磷酸酯键

原子核带正电核外电子带负电

亲核进攻：一个电子云密度大的基团 进攻带正电 或电子云密度较小的基团 从而发生的反应

在这里 羟基的氧进攻磷酸基的磷

本质上是一个亲核取代

DNA合成的方向5'→3'

DNA合成就是引物三端延伸的过程。

DNA合成的过程不可逆。

Steve Bell

引物-模板接头（DNA复制底物）

引物有一个游离的3'-OH

引物游离的羟基攻击dNTP的α-磷酸基团

脱下一分子焦磷酸盐

只有引物碱基与模板碱基正确配对时 反应才会发生

第二个反应会分解焦磷酸盐（PPi 由两分子的焦磷酸盐偶联形成）形成两分子磷酸 盐驱动反 从而使之不可逆

在磷酸盐酶的作用下，该反应的ΔG=-7kcal（ΔG<0时反应自发进行）

在没有磷酸盐酶的作用下，该反应的ΔG=-3.5-kcal

这仍是正反应 该过程是不可逆的

为了确保反应正向进行 细胞不止释放焦磷酸盐 而且还会迅速捕获焦磷酸盐 将其分解为两分子磷酸盐

DNA聚合酶催化了这个反应

DNA聚合酶需要：

1.引物3'端羟基

2.引物必须与另一条更长的单链DNA退火 因此需要引物3'羟基与单链DNA紧密相连

• 1&2结合起来称为引物-模板接（PTJ）

3.全部4种dNTP

4.加入的dNTP必须能与模板进行碱基互补配对

5.此化学反应会通过合成核苷酸链来延伸引物的3端

才能进行催化反应（被延长的始终是引物）

P5 DNA聚合酶的活性中心

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DNA聚合酶活性中心对脱氧核苷酸的识别

两个机制：

动力学机制

空间位阻

游离的rNTP是dNTP的200多倍 所以复制时不可避免出现添加rNTP的情况 空间位阻是阻止这种情况发生的机制（但不代表不发生）

发生后 要改

细胞通过RNaseH（RNA酶h）来切除错误添加的rNTP

RNaseH在真核生物里分为H1和H2 它们都能切除DNA-RNA的杂交区域

H1要有4个连续的rNMP才能识别

去除rNTP的主要是H2 可以切除单个核糖核苷酸 H2有周期性 切除核糖核苷酸主要是G2期

切除-修复机制：

H2可以在rNMP的5端把链断开 引入3'羟基和5'磷酸

然后从3'OH开始DNA聚合酶把缺口合成

这时产生了翅膀一样的结构——侧翼（就是一段NDA连了一个rNMP）

内切酶/外切酶把侧翼切掉 切口连接酶补起来

Steve Bell

DNA聚合酶只有一个活性位点

那它怎么做到添加4中dNTP？

DNA聚合酶它不在乎！

因为对于这四种碱基而言 距离是相同的

DNA不同的核苷酸是以完全相同的方式排列的

这对一酶多吃是至关重要的

核苷酸们只有形成碱基对 才能发生催化反应

当碱基正确配对时 只需要将三磷酸基团放在正确的位置

引物（primer）3'端的羟基就可以SN2亲核进攻（发生在磷酸基上）

如果A配A 尽管在结合的口袋附近有一定的亲和力 但磷酸基团的位置不正确 羟基不能亲核进攻它

错配类型不同 它的位置也不一样

α-磷酸基和3'羟基的位置正确才能发生反应（亲核进攻）

个个碱基对的尺寸相似 正确的碱基配对能让3'端羟基所处的位置距离dNTP的α-磷酸基团最近

这就是细胞保障聚合时双链配对正确

这一过程产生的错误越多 反应速度越慢

P6 DNA聚合酶活性中心对小沟的识别

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氢键：电负性大的原子结合的氢与另一个电负性大原子之间 静电引力

就是X——H丶丶丶Y

一般X Y基本是氧 氮 氟

当H和O N F结合的时候 比如H2O 氨气和氟化氢 这三个因为原子半径够小 电负性够大 所以共价键电子云极大偏向这些原子 氢核几乎裸露

电子云偏了以后 氢核带正电 这些电负性大的原子带负电 正负电荷之间互相吸引 形成氢键

共价键是共享

氢键是偏向 它比离子键共价键都弱 但是分子之间的·作用力强

氢键分两种形式：

• 分子间

分子间氢键会提高化合物的沸点

• 分子内

分子内氢键会降低化合物的沸点

给出氢原子的叫供体 接受氢原子的叫受体

氢键就是供体和受体间的库仑力

大沟：序列特异性

小沟：构象特异性

氢键任意一个碱基对 蛋白质从大沟能分辨出来是GC还是CG 但是从小沟看来是一样的

图上A是受体 D是供体

大沟上 如果是GC 那就是AADH 如果是CG就是HDAA 小沟都是ADA

Steve Bell

聚合酶的样子

DNA聚合酶有好几种 通常情况下 他们的基本结构都差不多

“fingers”在催化反应的过程中会动 thumb不动

手掌“palm”结合引物模板接头以及部分新合成的DNA

上图：

活性位点之后就是模板

后面的DNA单链弯曲了45度 这意味着活性位点附近唯一能配对的碱基是紧接着前面配对完成的那一个

聚合酶与无关序列的磷酸骨架结合

如果需要特异性序列结合蛋白质去识别DNA 那么它应该结合大沟

A供体 D受体

大沟中氢键的供体和受体有许多有趣的类型 它们差别很大

通过观察大沟 根据你得到的碱基对 你能得到其所有的信息 你可以分辨出它是GC（AT）残基还是GC （TA）残基

小沟只有中间氢键不同 两侧的氢键都一样 并且它们在完全相同的位置 因此无论碱基对是哪个 小沟中的氢键受体对都是一样的

小沟中互相作用没有序列特异性 但有碱基配对特异性

这使得DNA聚合酶能够无视序列特异性结合DNA 还能识别这就是碱基对

如果是AG 那就乱套了 它们的位置不对 聚合酶能识别这一点 这会使两个受体扭曲 聚合酶就会知道新合成的DNA不对

因此 它不仅能检测出所以不同的序列 还能检测碱基对是否正确

P7 DNA聚合酶手指结构域的催化原理

生命中国的叨叨

引物模板接头在掌心

手掌结构域上

合成位点包含2个二价金属离子 可以改变正确配对的dNTP与引物3'端羟基的化学环境

一个二价金属：ionA 另一个二价金属：ionB

ionA能够和引物的3'羟基的H相互作用

O进攻α-P 发生亲核取代 金属离子的作用就是活化羟基中的氧原子 即去质子化

ionB用来稳定β-P和γ-P 静电引力 反应玩就是PPi

手指结构域

当新进的dNTP正确配对的时候 手指结构域里有一个α-螺旋（steve bell叫O-螺旋 O-螺旋就是α-螺旋一种）

α-螺旋上的氨基酸残基能够和新近加入的dNTP相互作用 能让O-螺旋弯曲40° 让核心酶封闭起来（稳定dNTP）

α-螺旋上的酪氨酸（Tyr）会和碱基平面相互作用 酪氨酸是芳香族化合物 带苯环 会和核苷酸里的环形成π-π堆积（非共价键）

• π-π堆积是芳香化合物的一种特殊空间排布，指一种常常发生在 芳香环 之间的 弱相互作用 ，通常存在于相对富电子和缺电子的两个分子之间，是一种与氢键同样重要的非共价键相互作用。

另外两个氨基酸 赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）分别跟β-P和γ-P相互作用

Steve Bell

dNTP由碱基配对介导 同时整合了二价金属阳离子（通常Mg2+）

使用二价金属螯合剂 如EDTA之类的 几乎可以让任何DNA聚合酶失活

准备添加的核苷酸会和母链与之配对的碱基形成氢键 氢键是结合核苷酸的一种机制

另一种是三磷酸盐和二价金属的作用 提供额外支持 将核苷酸固定在应有的位置 从而保证催化的进行

同时发生的还有另一件事 也就是O-螺旋

以前说过 手指结构会在结合的dNTP周围开合 这就涉及O-螺旋

这是由于酪氨酸的环状结构 与添加的核苷酸之间形成了π-π键 互相作用发生在六元环部分

无论是一个六元环和一个五元环的嘌呤 还是只是一个六元环的嘧啶 都能与酪氨酸发生反应 促使O-螺旋靠近dNTP

另外 赖氨酸和精氨酸会和β、γ位的磷酸相互作用 这些相互作用使得O-螺旋被压到碱基对上方 一个重要作用是防止水解的发生 这样水就不能进入活性中心 唯一发生的反应就是羟基进攻磷酸基团

π-π键结合碱基

赖氨酸与精氨酸结合三磷酸盐

接下来

释放焦磷酸盐和O-螺旋

当两个磷酸基被释放时 赖氨酸和精氨酸对位于此位碱基的吸引力大大下降 它们会弹出去

如果它恢复原状 从有吸引力的状态变成没有吸引力的状态

这时当我们添加核苷酸完成时 它将不再是之前的样子

这里有对碱基对 但碱基对和聚合酶之间没有很强的相互作用 聚合酶希望这里能有个3'羟基而不是下一个位置

把单链DNA模板移动到这里 令DNA整个下降 聚合酶与这种形式的底物具有较高的相互作用

单链DNA只需移动一个位置就能做到 因为聚合酶与双链DNA的相互作用是非特异性的 所以从能量的角度而言 移动DNA相当于手掌位置移动一个碱基对

移动一个碱基对 不会改变与聚合酶间的相互作用 但和3端移动后的位置相比 原来的位置与DNA聚合酶间的相互作用要弱的多

移动一个碱基只需一毫秒

P8 DNA聚合酶的校正功能

生命中国的叨叨

手掌结构域，3→5的外切酶（一个酶一个结构域上不同的两个活性位点）

当错误的核苷酸掺入合成链的时候（互变异构）不需要把这盒内取下来换一套纠正的系统 聚合酶会自我纠正

当错配发生的时候 引物与活性中心亲和力降低 这样聚合酶就会等 合成速率就会跟着降低

随后引物脱离 与校正妹点结合 外切酶切除

然后引入重新和活性中心结合

这一套过程能让DNA聚合酶的保真度达到10的7次方分之一（一千万错一）

罪魁祸首：互变异构

两种官能团可以反复横跳（一个原子在两个位置之间秒速位移）

Steve Bell

DNA聚合酶大约每合成十万对碱基发生一次错误

大多数的错误是由于嘧啶换嘧啶或是漂亮换嘌呤造成的

如 它放了C而不是T 或者放了G而不是A

原因：互变异构体

所有四种碱基都能在醇式与烯醇式 氨基与亚氨基之间转换。

amino（氨基）imino（亚氨基）keto（酮式）enol（烯醇式）

上面的为正常形态

当它转化的同时 氢键的供受关系也会发生变化

会改变碱基配对的特异性

每10万个碱基会有一个发生变化 它会转变为另一种构象

（对于G来说就是烯醇式 它能与胸腺嘧啶T配对 但是聚合酶还以为配对正确 因为如果是A 结构也是一样的）

当碱基变构时 聚合酶无法区分 还开心的添加T以为完成任务

但一旦T添加进来 G就不是烯醇 它马上变回酮式

当他移动到下一个位置时 新加入的碱基就是错的了 DNA将不再维持双链 其末端会解旋 不在形成 这会令聚合酶停止工作

考虑到3端OH位置 它的位置非常巧妙 正好可以和α-磷酸基团相互作用

如果这个碱基是错误的 二者就会互相排斥 当轻剑不在互补时 就会出现这种情况 3端OH将不会出现在α-磷酸基团需要的位置

一旦出现错误 聚合酶会停下 互变异构体产生的错误的暂时的 但错配会减慢合成速度

它会使用校对核酸外切酶修正错误

P9 DNA聚合酶的核酸外切酶活性

生命中国的叨叨

上图大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

作为一个聚合酶 有水解的活性

合成和水解的活性中心在同一条肽链上 为了平衡二者关系 注定了这个酶活性不会太高

所以在大肠杆菌里 聚合酶Ⅲ真正负责合成

聚合酶Ⅰ主要用来修复和补口的

右图：“手”

3'5'外切酶是一个一个切的 切完之后可以用自己的聚合酶活性补上

正确配对 和合成中心亲和性高

错误配对 和校对中心亲和性高

这保证了不会出现两个中心同时被激活的情况

Steve Bell

这不是合成的逆反应 那边有一个P 所以不是合成的逆反应

because一旦两个磷酸分开 合成反应就是不可逆的

这些校对核酸外切酶先从一端降解DNA

校对核酸外切酶的工作方向是3'到5'

遇到错配反应会变慢 错配时末端会不稳定（至少最后一对碱基没有配对）

通常 外切酶活性 和聚合酶活性都在同一条肽链上 也就是说 这条多肽同时具备合成和降解两大技能

不稳定或错配时 DNA与聚合酶活性中心的亲和力低 但他有引入的单链DNA末端 或是3端羟基 与核酸外切酶的活性位点亲和性高

概括为此图

这个不稳定的末端是外切酶完美的底物

如果发生错配 没有足够的时间给外切酶修复 所以合成继续

后面会将讲解

P10 DNA聚合酶的检测方法——掺入法

生命中国的叨叨

掺入法

need：

噬菌体M13的基因组 单链的dna环 人工合成的引物（引物模板接头（PTJ）它必须接着复制）缓冲液 dNTP（4种dNTP至少1种被标记 可用荧光标记或放射性同位素）

滤纸分析 我们最后测的是总的荧光或总的放射性强度 分不清聚合酶合了多少

电泳可用分开 电影本身就是依据片段大小不一样 在凝胶里的电泳速度不同来分离的

Steve Bell

DNA聚合酶活性的检测方法

• 掺入法
• 需要把聚合物（DNA）从原料里（dNTP）分离出来

1.合成一个具有引物-模板接头的底物

一般用噬菌体M13 它的基因组是一个大的单链DNA 这些单链状环DNA能够被人工合成

M13有5000个碱基

这就是你的引物-模板接头

我们把引物和单链DNA放到一起 金属浴加热到100度 3分钟 拿出来放在那儿 然后放一段时间 退火就完成了

2.缓冲液+DNA聚合酶（我们认为里面有它）

3.加入dNTP开始反应（至少有一种dNTP被标记 一般是荧光标记或放射性同位素标记）

荧光标记一般加在一个胸苷类似物上 所以能标记碱基 只要胸苷上有甲基 你也可以加各种各样的东西上去 可以在甲基上连一个很大的七元环

或者用32P代替磷酸基中的α磷原子

4.取时间点 每个时间点通过SDS或EDTA终止反应 把DNA从标记过的dNTP中分离出来

如果你的合成反应进行的很成功 部分标记过的dNTP就会掺入DNA聚合酶中 剩下的还留在体系里

那么如何区分被标记的DNA和dNTP？

• 滤纸结合分析法

用一个带正电的滤纸 即离子交换纸（DE81）

把反应物点在滤纸上（好处在于反应马上停止 因为没有水）接着拿着膜 用含盐的缓冲剂漂洗

盐的浓度（一般用50mmol/L氯化钠）正好能洗掉dNTP 而不会波及DNA

dNTP有三个负电荷

DNA有几千个负电荷

要使分子从滤纸上洗脱下来 必须让他所有的负电荷同时从滤纸上脱离 盐离子可以做到这一点

当盐离子靠近并结合DNA的时候 它会取代滤纸上的正电荷 当dNTP只有3个负电荷时 两三毫秒就能脱离一个

你需要对地址进行漂洗 一般洗三次

同位素标记：收集上清 看看上清有没有放射性 可以不断的洗 直到上清里没有放射性为止 然后可以检测滤纸 看看上面放射性标记的含量

如果是荧光标记可能测起来不那么容易 但都是一个道理

接下来 测量相关的荧光或放射性强度 接着你就能计算参入核苷酸的含量 如果你准确制造最初用的核苷酸荧光或放射性强度 那么你就能精确算出有多少核苷酸参入到了模板上

滤纸结合分析法

优势是快 定量（多长时间多少个核苷酸参入了多少模板里）

缺点是不能够提供长度信息（不管是1000次10对碱基对的延伸 还是一次10000对碱基对的延伸 分析结果都完全相同）

如果想知道长度信息 就需要、

• 凝胶

把以前的东西在做一次 然后用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶

用TBE或TAE（一种缓冲液）配的琼脂糖凝胶

把DNA变性 让新合成的序列从环上脱离

如何变性？加热95°

完后 用琼脂糖凝胶 一般要加氢氧化钠

用聚丙烯酰胺凝胶 一般加尿素

加氢氧化钠和尿素的作用是能防止热变性的DNA重新退火（无法退火重新结合）

然后用凝胶分离就行了

溴化乙锭可以染核酸（无论有没有标记）

30/60/90/120秒 合成的产物越来越多 引物被稳定延长

一般不会反应掉所有模版 2/3模版被用掉了

只检测辐射或荧光 只能看见DNA分子 看不到引物和模版 因为没有被标记

凝胶

优点：告诉产物·长度信息

缺点：浪费时间·20~几个小时 定量效果不好

P11 DNA聚合酶的检测方法——引物延伸法

生命中国的叨叨

标记引物

需要的东西：模板、缓冲液、聚合酶、标记的引物、没标记的dNTP

如果只标记引物 得到的所有产物 荧光强度或者放射性强度都一样（Because引物是一样的 标记的量也一样）

跑胶的时候要用变性凝胶

变性凝胶：

如琼脂糖凝胶加氢氧化钠 聚丙烯酰胺凝胶加尿素 用来防止DNA复性 否则产物和模板在一块 会退火复性 就会产生很多不同结构 结构不同迁移率也不同

变性就是为了让核酸在凝胶中的迁移率和其他东西无关系 只和它的分子量有关

如果忘记用变性凝胶呢

这意味着产物和模板会结合在一起 跑出来如下图

中产物和模板差不太多，5000bp左右（取决于DNA聚合酶的合成能力）

Steve Bell

与掺入法的差别：被标记的是底物（在该实验为引物 被同位素或荧光标记）dNTPs不被标记

这样你合成了个标记的Primer Template Junction

标记一般必须在primer（引物）上

因为合成完后 引物就是产物一部分 而模板分离后就不是产物了

反映完后不能用滤纸分析

如果体系里完全没有DNA聚合酶 滤纸上会留存大量标记DNA 如果你完成了合成反应滤纸上一样会有大量标记DNA（因为起始底物与最终产物的标记量基本相同）

可以用凝胶分离

左图溴化乙锭染色（与原来结构差不多）

右图检测放射性同位素或荧光标记（产物越来越长 条带亮度差不多 因为无论产物是多少个碱基 它们引物标记的都是一样的）

P12 DNA聚合酶的续航能力及其检测

生命中国的叨叨

DNA聚合酶的续航能力——processivity（持续合成能力）

持续合成能力是酶针对聚合物的特征 聚合物是由单体构成の 所以酶就必须不断添加单体

即聚合酶结合引物模板接头的时候 所能添加dNTP的个数

不同的聚合酶持续合成能力是不一样的 用来修复的聚合酶 大概一次结合只能添加20个dNTP

如何检测？模板竞争分析（template challenge assay）

• 用两种PTJ 一种标记 一种不标记
• 然后加入两倍（指数量）标记PTJ浓度 的DNA聚合酶
• 这时 所有标记过的PTJ都结合上了聚合酶
• 下面 加入1000倍浓度的没有标记的PTJ 给时间让聚合酶继续反应 让它足够复制玩整个模板
• 跑胶

• 酶合成能力高可用完整复制（结合的PTJ一定会被标记 因为是先加入的聚合酶 再加入没有标记的PTJ）
• 合成能力低 跑一段 聚合酶就会脱落后再结合另一个PTJ 此时没有标记的PTJ比标记的PTJ多 大概率结合的是没有标记的PTJ 没标记的 测不出来 标记过的 结合不上 低续航能力的聚合酶只能合成几十个碱基就没了 也就是该图底下的这个

Steve Bell

持续合成能力

做用于聚合物的酶的性质

普通概念：每个聚合物结合的酶的反应循环数

DNA聚合酶概念：每次聚合酶结合引物模板接头的时候掺入dNTP的个数

在溶液中DNA聚合酶结合一个PTJ大约需要一秒钟（为扩散控制反应）

一旦与PTJ结合 聚合酶每掺入一个dNTP只需一毫秒

这意味着如果你已经有结合模板的聚合酶 那么在另一个聚合酶与心奴版结合之前，你能够合成1000个碱基对 所以 如果想合成大量DNA 需要一个能有效持续合成的dna聚合酶

聚合酶的持续合成能力千差万别 这种差别随着如DNA修复聚合酶的持续合成能力很差 合成PTJ时候大约合成10~20个碱基对

DNA或每次合成的PTJ时候能够合成>50000个碱基对

持续合成能力可以帮助我们区分哪种聚合酶适合哪类工作

那么如何知道它的持续合成能力如何？

模板竞争分析

1.准备两种PTJ 一种引物标记（PTJ，黄色高光表示被标记） 一种引物不标记（PTJ）还有一些缓冲液之类的老牌东西

2.加入PTJ 接着加入2倍PTJ浓度的聚合酶

3.然后向体系里加入没有标记的dNTP 开始合成反应 同时加入1000倍未标记的PTJ

现在所有PTJ都结合了聚合酶 然后加dNTP和大量没有标记的PTJ 然后让反应时间足够长 足以合成全长产物

30min后 终止反应 凝胶电泳分离产物

第一次结合PTJ后发生了什么事？

加入PTJ后 我们还加入了1000倍相同的没有标记的PTJ 所以聚合酶更容易结合到没有标记的PTJ 在那里合成下一串DNA 可是因为没有被标记 我们也看不到

所所以约等于只测第一次结合时的合成情况

P13 真实实验中的DNA群体行为

生命中国的叨叨

离心管里的反应不是一个模板 一个酶 而是成千上万的模板和酶

那为何不是一个模板一个酶？无法检测

如果单分子反应去跑胶 当然跑不出来

如果其他方式 如 单分子荧光检测

过去把生物材料均一化 认为DNA、细胞行为是一致的

实际上是用群体行为掩盖了个体差异 单分子反应很多时候不可预测 它是随机性在起作用 很多时候相同的基因型表现型不同 这是随机因素在起作用

Steve Bell（not）

在离心管中会发生什么？

我们真的只有一分子DNA和环状结构吗？

如果指望能单分子反应 现在来说还是想多了 我们不能看到任何结果

跑胶完了什么也看不见 因为单分子的信号太弱了

我们能在凝胶上看见的条带 是由长度相同 拓扑结构相同的所以他们能够迁移到凝胶里的同一位置

如果只有一个分子 那什么也看不见了

实际上我们的离心管里有大量分子

并不是每一个引物都能结合模板 也不是每一个引物模板接头都能结合聚合酶

但是因为基数大 所以基本上离心管里的分子还是会按照你预测的方式反应

所以跑胶后能看见你想要的结果

这也是为什么你经常还会看到凝胶底部朝着正极方向移动的引物二聚体

如果开始时候引物加的太多 那肯定会剩下

所以以后看到这种示意图的时候要知道这不是一个分子 而是千万亿个分子

P14 真实细胞中的DNA复制过程

生命中国的叨叨

细胞器是细胞里最容易观察的结构

两条链 打开

前导链3'→5' 持续合成 时间短

后随链5'→3' 一段段复制 冈崎片段

DNA聚合酶复制方向5'→3'

Steve Bell

复制叉

P15 DNA聚合酶和它的小伙伴儿

生命中国的叨叨

复制叉——Y形结构

从复制起点开始 它可以单项也可以双向

1.DNA聚合酶

不能从头合成 必须需要PTJ

2.DNA引物酶

本质是特殊的RNA聚合酶

3.DNA解旋酶

（具体见图片PPT）

滑动夹：

习题：

Steve Bell

大多数情况 cell里的DNA复制是从复制叉这个结果开始的

1.前导链DNA聚合酶

移动方向与整体复制方向相同

移动方向为尚未复制的DNA

2.后随链DNA聚合酶

移动方向背离DNA整体复制方向

后随链的复制需要一段段进行——冈崎片段（或后随链片段）

当冈崎片段遇到引物（下一个复制起始的引物）时 就会终止复制

因为没有东西给他复制了 没有PTJ 没有ssDNA 他就会解离下来 然后重新的引物那边再开始复制

3.引物酶primase

一种特殊的RNA聚合酶

在复制叉处合成6~8个碱基对的RNA引物

Q: 为何需引物酶？

A: dna聚合酶无法直接拿两个核苷酸开始合成型片段 它必须有一个引物

它需要PTJ 模板可以是RNA/DNA

RNA聚合酶不像DNA聚合酶 RNA聚合酶可以连接两个核糖核苷酸 开始成链

（在细菌中）引物酶在复制叉处起作用的原因在于 复制叉上的另一个酶会激活它 那个酶就是——

4.DNA解旋酶

见下节课

（在真核细胞中 解旋酶拉着引物酶紧密结合后随链聚合酶不分离）

P16 DNA解旋酶

生命中国的叨叨

DNA聚合酶：复制解旋酶

解旋酶环绕单链是活性状态

此过程为——装配

能量来源——***

解旋酶六个单体 每个都能结合***

这意味着它（解旋酶的每个亚基）有3个状态

1.***

2.ADP

3.不结合

这三种状态能量是不同的

每次转换的过程 都会有能量差 解旋酶也就是靠这个能量来打开碱基对的

它打开的是碱基对间的氢键

习题：

Steve Bell

需要解旋酶的原因：DNA聚合酶解旋解的太慢 大约慢10倍

• 复制解旋酶

环状六聚体

********NA解旋

围绕一条链来发挥作用 并且换一条链

复制解旋酶对六环外的东西毫不在意 但环内必须为DNA

它是如何做到的呢？

Q：只能穿单链？

A：没地方啦 一条链也很挤

Q：6个亚基不同状态？*** ADP 没有？

A：这六个亚基每个都是能够结合*** 箭头指的红色部***/ADP的结合位点 当然 并非所有亚基在任何时候***/ADP/核苷酸（即什么都不结合）

从结构而言 这6个亚基可能是在3中状态不断过渡

如果过程在来一遍 6个亚基都这样搞 DNA就会相对于解旋酶向下运动

这就是解旋酶工作的原理——结合、水解、释放、向上运动、再次结合

在细菌里 解旋酶围绕的是后随链

在真核生物里 解旋酶围绕的是前导链

P17 DNA解旋酶的活性及其检测方法

生命中国的叨叨

标记引物：

如果解旋酶有活性 那引物与模板会分开 20-25bp

如果解旋酶有活性 和模板差不多大小 约5000bp

习题：

盐：阳离子（带正电）

DNA：带负电

如果盐离子浓度低：

变性的两条DNA链 同极相斥 不容易复性（维持单链状态）

如果盐离子浓度高：

抵消一部分负电荷 两条链倾向碱基互补配对结合（复性）

复性后无论有无解旋酶 跑胶后都是模板的位置 2000多bp

Steve Bell

解旋酶不会形成或者破坏化学键 所以我们无法用掺入法 不能用放射性标记核苷酸或引物

相反我们需要观察复制解旋酶怎么改变DNA

示意图：

• 为什么低盐环境有利于DNA变性？

DNA：负电

你把两个DNA放在一块 他们会同级相斥

体系里盐浓度越高 斥力越小

所以盐浓度低 不能维系退火条件（变性）

P18 DNA解旋酶的极性及其检测方法

生命中国的叨叨

极性：方向性

极性由六聚体所结合的单链决定

可知：

解旋酶的极性不是固定的

结合的单链决定解旋酶的走向

检测：

拿引物（大约60个标记过的核苷酸）与模板（模板还是ssDNA）结合

结合后 结合的部分就是双链 然后用内切酶切开 两段引物长度不同（这看你切哪）

加解旋酶 跑胶 通过被标记的部分来判断解旋酶到底往哪边走

Steve Bell

解旋酶重要性质：

1.

在ssDNA的移动方向是一定的 这就是为什么它需要能量 因为它不光要移走DNA 也要只向一个方向移动

这叫做“极性”

方向可以5'→3' 也可以3'→5'

2.

解旋酶只能结合ssDNA

（没有空间结合dsDNA）

Q：模板哪个是5'哪个是3'？

A：用引物 引物是5→3' 那么模板一定是反的 也就是3'→5'（在引物的方向看）但换一个角度 可见是5'→3'

如图：

如何检测解旋酶的极性？

我们需要根据酶的进行方向不同来选择底物

• 把引物标记全长（掺入放射性同位素或荧光标记实现）
• 然后用一个平末端限制酶切它 这个限制酶会在引物区域内部不对称的切割
• 限制酶切的是双链而不是单链 要设计好 在合适的位置有酶切位点

解旋酶结合在没有标记的单链

之前说过细菌的解决没在后随链上移动

移动方向是5'→3' 如果是前导链上移动则相反

原核细胞复制叉 图

真核生物的酶想要在相反方向的链移动 就必需有相反的极性

P19 DNA单链结合蛋白

生命中国的叨叨

保护：让DNA存在 形态不确定

稳定：存在且形态一定

若双链打卡后放着 会有什么可能性？

降解、自我折叠（如果链内由互补结构） 、退火复性……

协同作用：

原核生物SSB一个之后 倾向于继续结合 直到铺满

这种协同作用可以以1000倍的速率增长

第一个SSB 1

第二个SSB 1000

第三个SSB 1000000

真核里：RPA（麸质蛋白A）

图：单链结合蛋白示意图

Steve Bell

Q:

怎样阻止两条链迅速结合？

A：

1.前导链聚合酶能够快速复制解旋酶后的ssDNA

2.SSB迅速结合后随链模板

SSB：

-SSB能够高亲和的结合ssDNA 而不是dsDNA

-SSB能够阻止双链DNA退火

-SSB以协同结合的方式结合ssDNA

-SSB结合的DNA很容易被聚合酶复制

-SSB结合的时候 碱基仍然暴露在外

SSB吸引聚合酶 ssDNA变成dsDNA SSB的亲和力也就没有那么强了 所以就脱落了

还有一些理论认为 聚合酶会对SSB脱落起到一定促进作用

P20 DNA的拓扑结构（上）

生命中国的叨叨

只要DNA不被打开 LK是不变的

LK0是一个基准

当完全没有超螺旋的时候 连环数由碱基对数决定

B型DNA：LK0=总碱基对数/10.4

（除于几 是因为每一圈螺旋有几个碱基对是一定的 其他型的DNA可以看它们每一圈的固定的碱基对数）

一般细胞中DNA负超螺旋多 松弛状态有助于贮存自由能 这个能量是用于供给拓扑异构酶的

Steve Bell

解旋酶把DNA两条链分开时 复制叉前方会积累过多的链结

如果强行分开双链 那么这些缠绕着的结构就会被压缩到越来越小的区域 它们越积越多 最终会导致复制终止

拓扑异构酶能够让次优解的DNA链结结构松弛

最优解：最优的DNA结构是每圈螺旋包含10.4个bp 这使得DNA处于不受力的状态

过度螺旋或正超螺旋DNA每圈<10.4bp

螺旋不足或负超螺旋DNA每圈>10.4bp

拓扑异构酶能让DNA尽可能地松弛下来 解开过度螺旋或螺旋不足的DNA

P21 DNA的拓扑结构（下）

生命中国的叨叨

DNA超螺旋：螺旋之螺旋

螺旋过度与螺旋不足实际上都是由完全松弛形成的

Q&A

一些定义：

LK一定是整数 而Tw可以是非整数（你缠半圈也可以的）

Wr也是超螺旋数

LK=Tw+Wr

这叫做DNA的三级结构

DNA真实图片

Steve Bell（not）

LK=Tw+Wr

一、扭转数Tw

扭转数是一条链完全缠绕零一条链的次数

如图：扭转数Tw=3 缠绕数Wr=0

二、缠绕数Wr

缠绕数是只双螺旋自我交叉的次数 其正负取决于缠绕方向

如图：缠绕数Wr=-1 因为它遵循右手定则 上端链从左向右

如图：缠绕数Wr=1

cccDNA（公家闭合环状DNA）

跟线性DNA不同 cccDNA在形状上收到拓扑结构的约束 这就意味着不可能在不断链的情况下改变LK

但如果增加或减少双螺旋上的Tw或Wr会发生什么呢？

• 螺旋过度的DNA每圈<10.4bp 所以它比松弛DNA缠的更紧 扭转数和连环数更大
• DNA过度螺旋是 连环数会增加 从而使DNA正超螺旋化 双链会自我缠绕形成正超螺旋
• 正超螺旋比松弛状态拥有更高的连环数 DNA的两条链能难分开

• 螺旋不足的DNA每圈多>10.4bp 因此螺旋不足时的DNA会比松弛状态更松 其扭转数与连环数更小
• 当DNA螺旋不足时 连环数减小 DNA形成负超螺旋 双链以与正超螺旋相反的方向缠绕 而产生扭矩
• 负超螺旋比松弛状态拥有更低的连环数 从而让双链更容易分开

但如果松弛是DNA约束最小的状态 那双螺旋是怎样从松弛状态变成过度螺旋或螺旋不足呢？正/负超螺旋又怎样恢复到松弛的状态呢？

拓扑异构酶！

这意味着拓扑异构酶能够吧过度螺旋的DNA放松 让连环数减少到更合适的每圈10.4个碱基对 或让螺旋不足的DNA重新缠绕 让连环数增加到更合适的每圈10.4bp

拓扑异构酶能切断1或2条链 并让相同数量的链穿过切口 这么做的结果是让拓扑结构受限的cccDNA连环数增加或是减少

拓扑异构酶有两类 Ⅰ型与Ⅱ型

Ⅰ型拓扑异构酶打开一条链 并让另一条链穿过切口 这样能让连环数增加或减少1

Ⅰ型拓扑异构酶行使功能无需额外能量

Ⅱ型拓扑异构酶会把两条链都打开 并让整个双螺旋穿过切口 这样能让连环数增加或减少2

Ⅱ型拓扑异构*********DH做能量

细菌也有一种特殊的Ⅱ型拓扑异构酶 叫做旋转酶 旋转酶通过耗能让DNA负超螺旋化 而不是恢复松弛状态

有些嗜热菌的拓扑异构酶让DNA正超螺旋化 而不是恢复松弛状态 因为它与旋转酶作用相反 也叫反旋转酶

Q:

如果DNA在松弛状态是不受张力的 那么为什么有些生物专门产生酶把DNA正超螺旋化或是负超螺旋化呢？

A:

蓄热菌和超级嗜热菌都生长在高温环境 约45~100℃ 嗜热菌DNA上的正超能够增加双螺旋的扭转数或缠绕数 进而增加连环数

这样的改变会使结构更稳定 防止DNA在高温下容易变性

实际上大多数生物的DNA都是负超 负超提供了储存自由能的场所 这有利于细胞中需要解旋的过程 如复制与转录

螺旋不足的DNA有自我分离的趋势 因此解旋比松弛态的DNA更容易

当分开负超螺旋时 DNA其他部分会产生更多的扭转 会让螺旋不足的链重新缠绕 而这时仍存在配对状态的DNA会恢复到理想的松弛态 而你会得到一天可用于转录或复制的ssDNA

如果你尝试打开松弛的双螺旋 结果就是过度螺旋或正超螺旋 这样的双螺旋在热力学上是不稳定的

P22 DNA的拓扑异构酶的类型与原理

生命中国的叨叨

• 拓扑异构酶能够破坏或连接糖-磷酸骨架 产生瞬时的DNA单链或双链断裂 从而改变DNA的拓扑结构

作用机理：断开-穿过-连接

拓扑异构酶Ⅰ：

酶的酪氨酸（Tyr）羟基进攻单链 和切口处的5'磷酸形成共价键

转酯反应：

酯：羟基和酸生成

酯化反应口诀：酸脱羟基醇脱氢

这里 酪氨酸的羟基代替了3'-羟基

Topo 1-Tyr-DNA中间体：

蛋白和核酸的复合物

一般消减负超（不代表不会消减正超） 消减后LK+1

拓扑异构酶Ⅱ

Steve Bell

拓扑异构酶能够让DNA的一条链断开 但它们仍然连接着断开的DNA两端

拓扑异构酶结合DNA上的一个点 利用酪氨酸上的羟基连接DNA两端

在这个过程中他与5'磷酸基形成共价键 与另一端3'羟基形成非共价键

接着它又使DNA重新结合

这个过程实际上是能量平衡的 所以拓扑异构酶不需*********能源来行使功能 因为它的所作所为能自给自足 完全受DNA里的能量驱动 它们也是通过这种方式感知修复DNA的—由DNA的能量状态来确定这一点

切开DNA后 它们与双链DNA结合 切开一条链 让另一条链穿过切口

拓扑异构酶Ⅰ切断一条链 让另一条链穿过切口

↑它也能这样工作

拓扑异构酶Ⅰ能够±1LK

拓扑异构酶Ⅱ：

拓扑异构酶Ⅱ能够切断并传递双链并传递双链

它切断双链 然后把它们固定住 它有2个活性位点 分别与两个5'端结合 并与3'以非共价键方式结合 之后再通过切口把后面的双链拉过来 重新连接切口

通过这一过程可以±2LK

拓扑异构酶Ⅱ还能解开两个连环DNA

环状DNA复制后会形成索环

当然拓扑异构酶Ⅰ也能做到（一条一条解）就是效率低

实际上 也许拓扑异构酶Ⅱ的出现最初不是为了解决拓扑学的问题 而是为了解决环状染色体演化之初的索环问题

P23 细菌中特殊的拓扑异构酶Ⅱ——螺旋酶

生命中国的叨叨

DNA螺旋酶目前只在细菌里发现

细菌的质粒、染色体……是环状的

复制或转录时不可避免的产生正超 所以要引入负超来消减压力

工作原理：

Gyrase-DNA复合体又是个蛋白核酸复合物

第二步是转酯反应 不需能量

习题：

Steve Bell

DNA螺旋酶：

切断DNA内部的链结 从而导致螺旋不足 或让DNA负超螺旋化

螺旋不足的DNA更容易解旋

一旦让它松弛下来 每单位长度DNA上的连环就增加了 而DNA上的应力并没有增加 从而使DNA更接近正确的结构

DNA螺旋酶能促进DNA解旋

复制和转录起始也需要它

嗜热菌体内有反螺旋酶

为了防止它们的DNA在95℃的环境里熔化 它们利用细胞的能量给DNA增加正超螺旋

在每种情况下 这些酶都需要能量

生物种类不同 所消耗能量的来源不同 ******DH

进而阻止DNA在自然环境下进行会进行的过程

这就是拓扑异构酶Ⅱ的特殊作用

拓扑异构酶Ⅰ完全不会

P24 拓扑异构酶的检测方法

生命中国的叨叨

琼脂糖凝胶：半乳糖和脱水半乳糖连起来的聚合物

这种聚合物的链长长短短 高温融了然后冷却凝固后会形成布满空洞的胶

跑胶时DNA就是穿过这些孔 即 电泳

电泳是带电粒子在电场中向电性相反的电极运动的过程

带电离子泳动的速率叫迁移率

核酸带负电 向正极迁移

一般来说 场强（电场强度）一定的时候 生物大分子的迁移率取决于其本身的大小和构象

“大小”即分子量 分子量相同的时候：

超螺旋DNA的迁移率>线性DNA>开环的松弛态DNA

如何检测拓扑异构酶的活性？

最右边的泳道 就是拓扑异构酶+DNA超螺旋的结果

• 要么是完全解开形成的松弛态（即跑的最慢的那个）（一般不会出现完全松弛的情况）
• 要么还是完全超螺旋状态
• 大量的都是中间态的超螺旋

补充：

• 非变性凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷 它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用
• 变性凝胶电泳形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物 其泳动速度主要由分子量决定

Steve Bell

我们可以利用拓扑异构酶作用前后DNA构象的改变来检测

如果用非变性凝胶跑胶环状DNA 一般来说在大肠杆菌里提的质粒有两个条带

对于没有被切割的DNA 其中一条是松弛状态的DNA （松弛状态的DNA是比如你在DNA一条链上切一个口 另外一条链就会很快[zizizizizi]解旋 直到达成某种平衡）

另外一条是负超螺旋DNA

（大肠杆菌里有螺旋酶 所以有负超）

超螺旋跑的比松弛状态的DNA快

why：

非变性琼脂糖凝胶是个网状结构 DNA必需穿过这些结构 所以体积越大结构越复杂就越难通过

超螺旋结构缠绕的越紧密 占用空间越小 就越容易通过网络

而大的松弛的结构占据空间也大 需要变形才能通过

所以松弛DNA比超螺旋DNA迁移的慢 而线性DNA迁移速度介于二者之间（方向正确迁移速度快 但它很难保持一直正确 经常绕来绕去）

松弛的DNA有切口 这条条带几乎没怎么变

超螺旋的DNA逐渐松弛 直到很接近完全松弛的状态

检测：

超螺旋DNA和拓扑异构酶一起孵育 然后跑一个琼脂糖电泳 然后用溴化乙锭染色

如何区分拓扑异构酶Ⅰ与拓扑异构酶Ⅱ：

在短膜虫的生物中 它有部分DNA是kDNA kDNA都锁在一起——索茎结构

它只能留在加样孔的顶部 因为它表现的像是比自己大一千倍的分子

当你加入拓扑异构酶Ⅰ 因为没有ssDNA 所以无法打开这些索茎

但加入拓扑异构酶Ⅱ 它能迅速打开这些索茎 形成一个个独立的环 这些环能够迅速在凝胶里迁移

就先到这了哈