Rheb泛素化调控生长因子诱导的mTORC1激活

写在前面

        今天推荐的是由同济大学生命科学与技术学院团队在2019年2月发表于CellResearch（IF：17.916，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Ping Wang教授，研究表明Rheb介导的mTORC1激活是由Rheb泛素化和去泛素化之间的动态对立事件调控的。

研究背景

        mTORC1是所有真核生物中保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它在整合各种环境信号调节细胞生长和代谢中起着关键作用。mTORC1复合体由mTOR、mLST8和Raptor组成，是Raf-MEK-ERK和PI3K-PDK1-AKT信号通路的下游节点。激活的mTORC1可以磷酸化包括S6K、4EBP1、ULK1和TFEB在内的多种底物。mTOR信号失控与多种疾病密切相关，包括癌症、代谢性疾病和发育障碍。因此，在正常情况下，mTOR在多个水平上受到严格控制。

        作为对各种环境信号的响应，mTORC1在溶酶体上通过两种Ras相关的小G蛋白Rheb-和Rag-GTPase相互作用而被激活。然而，目前关于Rheb活性的调控机制仍知之甚少。TSC复合体被认为是Rheb的主要上游调节因子，该复合物通过将Rheb从活性形式(GTP结合的Rheb)转变为非活性形式(GDP结合的Rheb)来负调控mTORC1的活性。最近的研究表明，E3连接酶RNF152和SKP2介导的RagA的k63多泛素化强烈抑制mTORC1的活化，同时，TRAF6介导mTOR的K63泛素化是mTORC1激活所必需的。

摘要部分

        作者发现，Rheb的泛素化控制着它与核苷酸的结合状态。研究表明，溶酶体锚定的E3连接酶RNF152催化Rheb的泛素化并促进其与TSC复合物结合。另外，EGF通过AKT依赖的USP4磷酸化促进Rheb的去泛素化，导致Rheb从TSC复合体中释放出来。这表明，在功能上，Rheb的泛素化与mTORC1介导的信号转导相联系，从而调节肿瘤的生长。因此，作者提出了一个机制模型，其中Rheb介导的mTORC1激活是由Rheb的泛素化和去泛素化之间的动态对立事件决定的，而Rheb泛素化和去泛素化分别由RNF152和USP4催化。作者的研究结果还揭示了关于mTORC1激活介导的肿瘤发生机制，该研究结果可能有助于未来癌症治疗的研究。

研究内容

1.TSC复合物和EGF信号调控Rheb的泛素化     

        作为mTORC1信号通路的关键负调控因子，TSC复合物主要作为GAP使RhebGTPase失活。然而，作者发现TSC1、TSC2或TBC1D7的表达促进了HEK293T细胞中Rheb的泛素化。作者使用泛素突变体（R72A：不能被泛素激活酶E1激活）作为阴性对照，证实了TSC2可诱导Rheb的泛素化。此外，数据显示敲低TSC1或TSC2会降低Rheb的泛素化水平，这说明内源性TSC复合体介导了Rheb的泛素化。

        鉴于TSC2是Rheb的GAP，作者研究了TSC2的GAP功能是否参与调控Rheb泛素化。数据表明，缺乏GAP活性的突变体TSC2-3Q丧失了促进Rheb泛素化的能力，并且不能抑制mTORC1的活化。说明Rheb的泛素化依赖于TSC复合物的GAP活性。     

        为了确定是哪种类型的泛素链锚定在Rheb上，作者在293T细胞中共表达Rheb和不同赖氨酸突变的泛素突变体，结果发现所有泛素突变体的表达都对TSC2诱导的Rheb泛素化没有影响。这表明TSC2可能主要促进Rheb的单泛素化。

        众所周知，TSC对Rheb活性受生长因子调控。数据显示，EGF处理降低了内源性和外源性Rheb的泛素化水平。另外，作者通过纯化细胞内溶酶体来检测Rheb是否在溶酶体上被泛素化，并发现溶酶体Rheb在饥饿时确实发生大量泛素化，而当EGF处理时，其泛素化被抑制。

        由于TSC2可以使Rheb失活并促进其从GTP-结合形式转化为GDP-结合形式，作者研究了Rheb泛素化是否受其核苷酸结合状态的影响。数据显示，Rheb失活突变体的泛素化作用远强于其活性突变体，表明泛素化与Rheb失活密切相关。

研究结论：Rheb泛素化需要TSC复合物的GAP活性，其中TSC2可能主要促进Rheb的单泛素化。另外，Rheb的泛素化与其失活密切相关，而EGF处理会抑制Rheb的泛素化。

2.RNF152是Rheb的E3泛素连接酶

        作者筛选了一组E3连接酶，以确定催化Rheb泛素化的特异性E3连接酶。作者发现溶酶体的RNF152的过表达会诱导Rheb的泛素化，而在RNF152敲除的细胞系中，内源性和外源性Rheb的泛素化水平均降低。另外，作者还从大肠杆菌中纯化了RNF152和Rheb并进行体外泛素化试验。数据表明RNF152在体外可对Rheb进行泛素化。

        接下来作者检查RNF152是否可以与Rheb相互作用。免疫共沉淀和体外下拉实验结果均显示RNF152可以与Rheb相互作用。作者还发现，与Rheb-GTP相比，RNF152会优先结合到Rheb-GDP上，这表明Rheb和RNF152之间的相互作用受Rheb的核苷酸结合状态的影响。一系列的研究数据表明，RNF152是Rheb的直接结合伴侣分子。

        为了定位RNF152介导的Rheb泛素化位点，作者检测了RNF152介导不同Rheb突变体的泛素化效果。数据显示，RNF152诱导的Rheb-K8R的泛素化减少，但其他突变体没有减少，这表明Rheb的K8残基是其泛素化的主要位点。

 研究结论：RNF152作为E3泛素连接酶可与Rheb相互作用并促进其泛素化，Rheb的K8残基是其泛素化的主要位点。

3.RNF152参与TSC2介导的Rheb泛素化 
        作者接下来研究了RNF152是否参与TSC2介导的Rheb泛素化。数据显示RNF152的过表达增强了TSC2介导的Rheb泛素化，而RNF152缺失则导致TSC2诱导的Rheb泛素化水平下降。此外，TSC2存在的情况下Rheb-K8R突变体的泛素化被抑制。这些数据共同表明，TSC2介导的Rheb泛素化在很大程度上依赖于RNF152。

        作者发现，野生型TSC2可以促进RNF152和Rheb之间的相互作用，而失去GAP活性的TSC2突变体则不行。另外实验显示，TSC2的缺失抑制了RNF152诱导的Rheb泛素化。这些数据表明，TSC2以TSC2-GAP活性依赖的方式促进Rheb与RNF152的结合。

        作者还研究了RNF152和Rheb之间的相互作用是否依赖于Rheb的核苷酸结合状态。数据显示RNF152与Rheb的失活突变体的结合比其与活性突变体的结合强得多。这些结果与另一数据一致，即RNF152和Rheb之间的相互作用被EGF抑制，并诱导Rheb处于GTP结合的活性状态。

 研究结论：TSC复合物或去除EGF会诱导GDP结合Rheb，从而促进Rheb和RNF152之间的相互作用并导致Rheb泛素化。

4.USP4介导Rheb的去泛素化

        为鉴定Rheb的去泛素化酶，作者对多种DUBs进行了筛选，并发现USP4、USP5、USP11、USP15和USP22等多个DUBs的过表达可以去除Rheb上连接的泛素链。然而，数据显示只有USP4与Rheb相互作用，而且USP4的DUSP结构域是其与Rheb相互作用所必需的。

        作者接下来探究USP4是否为Rheb的去泛素化酶。数据显示，野生型USP4的过表达抑制了TSC2/RNF152介导的Rheb泛素化，而其无酶活突变USP-CS不能抑制。作者还发现USP4和RNF152在与Rheb的相互作用中没有竞争关系。用Vialinin A（一种抑制USP4的DUB活性的小分子）处理可以抑制USP4介导的Rheb去泛素化并提升Rheb的泛素化水平。另外，体外去泛素化试验显示，USP4可以在体外直接对Rheb进行去泛素化。

 研究结论：USP4可以直接对Rheb进行去泛素化，即USP4是Rheb的直接去泛素化酶。

5.生长因子通过USP4磷酸化调控Rheb的泛素化       

        作者探究了USP4与Rheb的相互作用是否受EGF的影响，结果发现EGF处理在内源和外源水平均促进了它们的相互作用。据报道，EGF可诱导AKT磷酸化USP4，于是作者设计了USP4去磷酸化（USP4-S445A）和磷酸化（USP4-S445D）模拟突变体。研究显示USP4-S445A几乎不与Rheb结合，相反，Rheb和USP4-S445D突变体之间的相互作用很容易检测到。另一方面，USP4-WT和USP4-S445D的过表达也降低了TSC2/RNF152诱导的Rheb泛素化水平。此外，实验表明，AKT抑制剂（MK2206）破坏了USP4和Rheb之间的相互作用，并促进Rheb泛素化。

 研究结论：EGF可以促进USP4与Rheb的相互作用，并通过诱导USP4的S445磷酸化来调控Rheb的去泛素化。

6.Rheb的泛素化抑制其活性

        泛素化除了作为蛋白水解信号使底物靶向到蛋白酶体降解，还可以作为调节靶蛋白活性的信号。作者的数据显示RNF152和TSC2都不能影响Rheb蛋白的稳定性，进一步的研究表明，Rheb的单泛素化不参与其降解。     
        然后作者使用GTP下拉实验研究Rheb泛素化是否对其激活有影响。数据显示，RNF152的敲除诱导Rheb活化。另外，Rheb-K8R与GTP的结合能力比Rheb-WT更强，而且TSC2未能使Rheb-K8R失活。这些都表明，泛素化负调控Rheb的激活。

        作者接下来探究了USP4是否参与Rheb活化。数据显示，USP4的缺失以及Vialinin A对USP4活性的抑制降低了Rheb的活性。这表明USP4的去泛素化酶活性是Rheb活化所必需的。同时，USP4-WT和USP4-S445D的表达促进了Rheb的活化，而USP4-S445A的表达不能。

 研究结论：RNF152对Rheb的泛素化抑制了Rheb的激活，而USP4通过去泛素化促进Rheb激活，且这一过程受EGF调控。

7.Rheb的泛素化促进其与TSC2相互作用

        接下来作者研究了Rheb泛素化是否影响其与TSCs的相互作用。数据显示，泛素化的Rheb与TSC2的结合能力增强。另外，与Rheb-WT相比，Rheb-K8R突变体与TSC2的结合亲和力要弱得多。这些数据共同表明，Rheb的K8位点的泛素化增强了其与TSC2的结合。

        作者还研究了RNF152是否影响TSC和Rheb之间的相互作用。结果发现当RNF152缺失时，Rheb和TSC之间的相互作用减少。与此一致，RNF152促进了Rheb与TSC2的结合。此外，USP4的过表达阻断了Rheb和TSC2之间的相互作用。

        近期研究表明，TSC复合物在溶酶体中通过与Rheb的相互作用抑制Rheb的激活。作者的数据显示，TSC2和LAMP2（溶酶体关联膜蛋白2）的共定位在RNF152敲除的细胞中减少，而USP4敲除细胞中观察到了相反的结果。这些数据表明RNF152介导的Rheb泛素化增强了其与TSC2的结合，同时，USP4从Rheb中去除泛素并促进TSC与Rheb分离。

 研究结论：Rheb的泛素化可促进其与TSC2的相互作用，而去泛素化则促进TSC与Rheb的分离。

8.Rheb的泛素化抑制mTORC1的激活

        先前的研究揭示了Rheb在EGF刺激下的mTORC1活化中起关键作用。因此，作者通过检测S6K、S6和/或4EBP1的磷酸化水平来检测Rheb泛素化是否调控mTORC1的激活。数据显示，MEFs中RNF152的缺失促进了EGF诱导的mTORC1激活，而RNF152的过表达则起抑制作用。在EGF处理后，Rheb-K8R细胞显示出比Rheb-WT更强的激活mTORC1的能力。此外，Rheb-K8R介导的mTORC1激活对TSC2和RNF152的抑制作用具有抵抗力，这表明TSC2/RNF152介导的Rheb泛素化以EGF敏感的方式负调节mTORC1的激活。

        作者还探究了USP4是否对EGF诱导的mTORC1激活有影响。数据显示，USP4-WT的过表达促进EGF依赖的mTORC1激活，而USP4-CS不能。各种细胞中USP4的缺失则抑制了EGF诱导的mTORC1激活。此外，USP4抑制剂Vialinin A处理几乎完全阻断了EGF诱导的S6K、S6和4EBP1的磷酸化。

 研究结论：TSC2/RNF152介导的Rheb泛素化会抑制mTORC1激活，而USP4介导的Rheb去泛素化则促进了EGF诱导的mTORC1激活。

9.RNF152和USP4通过调控Rheb的泛素化调控细胞自噬、细胞增殖和细胞大小

        mTORC1是自噬的负性调节因子，作者研究了RNF152抑制和USP4促进诱导的mTORC1激活是否影响细胞自噬。数据显示RNF152的缺失导致LC3II水平的降低。此外，在RNF152缺失的MEFs中自噬受到抑制，而在HEK293T细胞中过表达RNF152可以促进自噬。研究表明RNF152介导的Rheb泛素化可调控细胞自噬。

        作者还研究了USP4是否参与调节mTORC1介导的细胞功能。结果发现USP4的敲低或敲除会导致LC3II水平的急剧增加，而Vialinin A处理降低了p62和磷酸化ULK1的水平。此外，USP4-WT的表达抑制了细胞自噬。

        由于mTORC1还是细胞增殖和细胞大小的主要调节因子，作者研究了USP4在调控细胞增殖和细胞大小中的生物学意义。结果发现USP4的缺失或Vialinin A的处理抑制了细胞增殖，而Rheb-K8R的表达促进了细胞增殖，并消除了siUSP4和Vialinin A的抑制作用。另外，USP4敲除或Vialinin A处理使得细胞变小。

 研究结论：USP4是mTORC1介导细胞活动的正调控因子，包括控制细胞自噬、细胞增殖和细胞大小，而RNF152为负调控因子。

10.RNF152和USP4在体内以mTORC1依赖的方式调控肿瘤生长      

        接着作者研究了RNF152和USP4是否参与mTORC1介导的体内肿瘤发生。数据显示，RNF152缺失的SW620细胞表现出很强的肿瘤形成能力，并且生长速度很快。p-S6的WB结果显示RNF152的敲除导致肿瘤中mTORC1的激活。同时，USP4的敲除导致肿瘤变小，且p-S6的表达水平降低，而Rheb-K8R的表达消除了这一效应。

        作者还构建了USP4基因敲除小鼠，并利用小鼠的结直肠肿瘤模型研究了USP4在结直肠癌中的作用。研究发现，与野生型小鼠相比，USP4-/-小鼠产生的肿瘤集落较少，而且野生型小鼠的体重减轻多于USP4-/-小鼠。实验显示，在USP4-/-小鼠的肿瘤样本中，mTORC1活性下降。另外，作者通过检索TCGA数据库分析了RNF152的表达水平，发现RNF152在各种类型癌症中表达下调，包括结肠癌、肺癌、肾癌和肝癌。

研究结论：RNF152和USP4通过调控mTORC1的激活在肿瘤生长中发挥重要作用。

结论与讨论

        研究表明,RNF152和USP4构成了一个复杂的调控网络，控制着Rheb-GDP(失活状态)和Rheb-GTP(激活状态)之间的转换，从而严重影响mTORC1的激活、自噬、细胞增殖和肿瘤发生。此外，USP4基因缺失或USP4抑制剂Vialinin A的治疗可抑制结直肠癌的生长，暗示了USP4抑制剂在未来癌症治疗中的潜在临床应用。总之，作者的研究揭示了Rheb活性的一种调控机制，通过该机制,Rheb泛素化的翻译后修饰决定mTORC1激活和随后的肿瘤发生。

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41422-018-0120-9