张奇：纳米抗体替代IgG抗体固定化增强纸基夹心免疫传感器的灵敏度...

【引语】

    产毒微生物广泛存在于人们的生活环境和食物中，对动物和人类健康构成极大威胁。A.flavus和A.parasiticus是主要产生黄曲霉毒素的曲霉菌属。这些能产生黄曲霉毒素的物种被称为黄曲霉毒素真菌。在黄曲霉毒素真菌中，A.flavus在土壤中约占94%。黄曲霉不仅存在于田间土壤等环境中，而且广泛存在于花生、玉米、水稻、小麦、棉花等农产品中。黄曲霉毒素是一类真菌的次生代谢产物，被称为危害最大、污染最广的霉菌毒素。国际癌症研究机构(IARC)将黄曲霉毒素B1定义为I类致癌物。其对人类肝癌新发病例的致病率高达28.2%。根据FAO数据，每年约有25%的谷物被霉菌毒素污染。鉴于黄曲霉毒素真菌的威胁，发展高灵敏度的检测技术具有重要意义。

    提高检测灵敏度是分析化学领域永恒的主题。以更高的灵敏度检测有毒微生物，意味着可以更早发现污染风险，为早期防控提供科学依据。近年来，纳米抗体在分析化学领域发展迅速，已有报道用于检测农产品中的小分子污染物。纳米抗体具有特异性强、稳定性高、产量高等优点。除了以上报道优势，纳米抗体能否提高大分子检测领域的检测灵敏度？如何提高检测灵敏度？到目前为止，还没有答案。纸基免疫传感器，尤其是免疫层析试纸条技术是一种快速定量的方法，已广泛应用于食品和农业中有害物质的检测。迄今为止，关于如何通过纳米抗体提高TRFIA对大分子危害物的检测灵敏度，几乎没有相关研究。

    本研究以产黄曲霉毒素真菌为例，以纸基免疫传感器为检测技术，研究如何利用纳米抗体提高检测灵敏度。基于先前获得的可用于鉴定黄曲霉毒素黄曲霉和寄生曲霉生物标志物的特异性纳米抗体和多克隆抗体，开发了一种高灵敏度的纸基夹心免疫传感器，通过将纳米抗体代替IgG抗体进行固定化，为其他大分子危害的高灵敏检测提供了新途径。

【成果简介】  

1、Eu/Tb (III)纳米微球与抗体偶联的优化和表征

    Eu/Tb(III)微球的-COOH被EDC激活，与抗体形成酰胺键完成连接反应。当加入20 µL EDC溶液时，Eu/Tb (III) 微球显示出高稳定性和荧光强度。抗体剂量对共轭荧光有很大影响。数据显示，60 μg PO8-VHH和多克隆抗体在偶联反应中均产生最高的偶联物荧光（图1a）。FTIR用于分析Eu/Tb (III)微球（图1b）。已知蛋白质酰胺结构FTIR在1600-1700 cm−1具有特征。1602 cm−1处的伸缩振动吸收表明蛋白酰胺结构成功装饰在Eu/Tb (III)微球表面。Eu/Tb (III)免疫探针的形态通过TEM表征（图 1c）。微粒偶联的探针呈规则圆形，粒子间大小比较均匀。直径为196 nm，均匀分散在溶液中。这种抗体与Eu/Tb(III)微球偶联的过程不应引起微球荧光强度衰减过大，否则会影响检测的灵敏度。在500 nm~700 nm波长范围内扫描Eu/Tb(III)微球的荧光强度（图1d）。结果表明抗体无荧光信号峰，PO8-VHH探针和多克隆抗体探针的荧光强度与裸微球接近，表明偶联探针可用于进一步的实验。

2、纸基夹心免疫传感器两种模式的比较

     对于两种抗体（纳米抗体和多克隆抗体），理论上存在两种夹心模式，如图2所示，（1）膜上的纳米抗体-生物标志物-Eu/Tb标记的多克隆抗体（III）粒子模式和（2）膜上的多克隆抗体-生物标志物-Eu/Tb (III)粒子模式标记的纳米抗体。为了描述和比较这两种模式，我们假设固定在膜上的纳米抗体分子数为A（因此，理论上固定在膜上的IgG抗体分子数应为0.1*A，因为纳米抗体大小约为0.1倍的IgG抗体），每个生物标志物分子上有X个不同的抗原表位（即总共可以结合X个多克隆抗体分子），多克隆抗体中针对该生物标志物的抗体的比例为Y，每个标记的抗体分子（即纳米抗体或多克隆抗体）的荧光信号值为B，说明所有反应中的生物标志物数量足够，理论上所有反应均已完成。

      根据上述，在模式(1)中，将纳米抗体(编号为A)固定在膜上，可以捕获A个生物标志物，进而可以捕获标记的多克隆抗体为A*(X-1)。因此，最终该模式下检测信号Fmax-1的最大值为A*(X-1)，如式(1)所示。

Fmax-1=A*(X-1), in which X is ≥2                  (1)

     在模式（2）中，将多克隆抗体（编号为A）固定在膜上，可以捕获（0.1*A*Y）*2个生物标志物分子，然后(0.1*A*Y)*2个标记的纳米抗体可以被捕获。因此，最终该模式下检测信号Fmax-2的最大值为0.2*A*Y，如式(2)所示。

Fmax-2=0.2*A*Y, in which Y is much less than 1%         (2)

    所以，理论上只需要比较哪个最大值更大，就应该选择信号更大的模式进行进一步的研究。比较Fmax-1和Fmax-2，结果如式(3)所示。

Fmax-1 / Fmax-2 = [A*(X-1)] ÷ [0⋅2*A*Y] ≥ 500            (3)

    根据式（3），模式（1）下检测信号的最大值至少是模式（2）下的500倍。在比较两种模式的实验中，当相同浓度的靶标加入反应孔时，模式（1）中的检测信号很容易观察到，但我们从未在模式（2）中观察到任何检测信号。模式(2)的检出限接近0.1 mg/mL，恰好验证了上述理论分析的正确性。因此，本文选择模式（1）进行进一步研究。

3、纸基夹心免疫传感器的构建与组装

     根据以上结果，选择纳米抗体固定在膜上的方式进一步构建免疫传感器。将浓度为0.25 mg/mL的纳米抗体（T线）和山羊抗兔IgG（C线）以0.6 µL/cm的速率喷洒在膜上。NC膜（Whatman FF120）和样品垫（Fushion 3）依次固定在塑料底板上。将组装好的条带用切条机切割成宽度为4mm的标准条带。准备好的测试条在4°C下至少可稳定保存180天。反应缓冲液为1%蔗糖+2.5% Tween-20+0.5% PVP K30，PBS缓冲液（0.01 M，pH 7.4）。将免疫探针用反应缓冲液稀释100倍，将免疫探针/样品（1:9）加入微孔中进行免疫层析。因此，每批免疫探针可用于5000个样本。

4、纸基夹心免疫传感器TRFIA的优化

     为了保证反应速率的一致性，一般选择抗原抗体反应的最佳温度为37℃。固定化纳米抗体完全捕获抗原需要一定的时间。在本实验中，在40min内每5min记录一次T线荧光强度与C线荧光强度的比值（FIT/FIC）（图3a）。结果表明，随着反应时间的延长，FIT/FIC信号逐渐减弱。15 min后荧光强度比值趋于稳定，说明最佳反应时间为15 min。将黄曲霉毒素真菌菌丝体溶液（生物标志物参考）稀释成不同浓度（0.01、0.1、1、10、100、1000 μg/mL），并通过同一批纸基免疫传感器进行检测（图3b）。以黄曲霉菌丝体浓度的对数为横坐标，以FIT/FIC为纵坐标绘制相应的标准曲线。如图3c所示，标准曲线方程为y=1.46251–1.17302/(1+x/0.06639)0.57226)，R2=0.9998。标准曲线检出限为0.035 μg/mL，肉眼目测检出限为0.1 μg/mL。

5、方法评价

    在空白花生样品和液体培养基中进行4次重复实验做基质效应研究。纸基免疫传感器对花生和液体培养基中黄曲霉毒素真菌的检测限分别为0.085 μg/mL和0.23 μg/mL（图4）。该结果表明浓度为4 mg/mL的花生基质和液态培养基对检测的影响很小。检测范围分别为0.085–323.56 μg/mL和0.23–327.55 μg/mL。该灵敏度满足了黄曲霉毒素真菌监测在食品和环境中的实际应用。

     计算回收率和组内、组间变异系数，考察方法的准确度和精密度。表1显示平均回收率为77.02~91.61%，回收率较好，与ELISA法相当。日内变异系数为8.66~11.69%，日间变异系数为7.93~12.57%。实验结果表明，所建立的TRFIA方法的回收率、精密度和重现性均在可接受的范围内。采用TRFIA和已报道的ELISA对8个盲样进行检测，两种检测方法结果一致（表2），说明TRFIA方法可靠，检测时间短于ELISA方法。

6、重要应用

     通过花生接种实验，利用建立的检测方法揭示黄曲霉产毒真菌和黄曲霉毒素的变化趋势。结果表明，接种后第2天即可检出产黄曲霉毒素的真菌，第4天可初步检出黄曲霉毒素（图5a）。从第8天开始，黄曲霉产毒真菌和黄曲霉毒素的检出量急剧上升，这与产黄曲霉产毒真菌的繁殖加速有关。因此，该方法可以在黄曲霉毒素产生之前检测黄曲霉毒素真菌，从而通过黄曲霉毒素真菌的早期检测减少黄曲霉毒素污染。

    土壤是黄曲霉的主要栖息地，也是花生中黄曲霉毒素真菌的主要来源。花生果实被黄曲霉毒素污染的主要原因是直接接触土壤中的黄曲霉毒素。本研究从中国五个花生产区采集了土壤样品，并通过纸基夹心免疫传感器评估了田间黄曲霉毒素真菌污染的丰度。如图（图5b）所示，HNAH的黄曲霉产毒真菌最高，LNFX最低，花生产区黄曲霉丰度差异显着。该检测方法揭示了环境中黄曲霉毒素真菌的早期风险，在黄曲霉毒素真菌污染程度高的地区应立即采取现场防控措施，避免造成更大的经济损失。

【小结】

    以黄曲霉毒素真菌为例，本研究报告了一种纸基夹心免疫传感器提高大分子检测灵敏度的方法。当纳米抗体固定在NC膜上时，其灵敏度至少是IgG固定模式的500倍，样品检测的反应时间为15min。纸基免疫传感器对黄曲霉毒素真菌的检出限为0.035 μg/mL，在花生和液体培养基中的检出范围分别为0.085–323.56 μg/mL和0.23–327.55 μg/mL。该模型还表现出令人满意的回收率(77.02%~91.61%)、选择性和重现性。两个重要的应用案例成功证明了花生和花生根际土壤中黄曲霉毒素真菌的丰度，表明该方法对实际样品中的黄曲霉毒素真菌具有良好的适用性。基于黄曲霉毒素真菌固定化纳米抗体的时间分辨纸基夹心免疫传感器的成功建立，为检测大分子有害物质高灵敏度免疫传感器的开发提供了新途径。

【原文出处】

Yan, H., Fu, J., Tang, X., Wang, D., Zhang, Q., Li, P. Sensitivity enhancement of paper-based sandwich immunosensor via nanobody immobilization instead of IgG antibody, taking aflatoxingenetic fungi as an analyte example. Sensors and Actuators B: Chemical, 2022, 373.

指导老师：王战辉

文章转载自：抗体故事微信公众号