用病毒载体做体内基因敲除？快进来看看~

做基因敲除大家首先想到的是Crispr/Cas9技术，这也是目前最为流行和应用广泛的基因编辑技术。虽然Crispr/Cas9编辑效率高，能精准定位目标区域，但是它脱靶率不容忽视。在细胞水平做敲除，我们需要经过长期的单克隆筛选才能最终得到完全敲除目的基因的细胞系，而在动物体内没办法做到这样的筛选过程，因此基本很难通过病毒转导Cas9和gRNA来完全敲除组织或细胞中的目的基因，一般整体上只能达到敲低的效果。

那么想利用病毒载体做体内敲除有没有其他方法呢？答案是肯定的。Cre-loxp系统也是一种基因编辑技术，可以用于细胞或动物水平的特异性删除或插入基因。Cre-loxp系统由重组酶Cre和它的特异性识别位点loxp序列组成，其中loxp序列具有方向性，可以利用它的方向性来达到不同的编辑目的，具体可以查看咱们往期的文章“Cre-loxP重组酶系统应用全攻略”。我们今天主要来看下它的敲除方法，当目的序列两端loxp位点的方向是同向时，cre酶识别位点并切割后，即可删除两个loxp位点之间序列（图1），从而达到敲除的目的。

图1 cre-loxp系统敲除目的序列示意图

  了解cre-loxp系统的敲除策略后，如何结合病毒应用到体内呢？首要的条件是需要获得flox小鼠（或其他动物），即小鼠全身或特定组织或细胞中的目的基因两端带有同向的loxp位点，可表示为A基因flox/flox小鼠；然后即可通过构建表达cre的腺相关病毒（AAV-Cre），同时可以带上针对特定组织或细胞的血清型和启动子，来达到更为高效准确的cre表达，从而进行基因敲除（图2）。AAV-cre结合flox小鼠可以快速实现动物体内基因敲除的目的。

图2 用cre病毒和loxp转基因小鼠进行基因敲除

  除此之外，运用cre-loxp还可以实现时间特异性的重组调控。在Cre酶的C端融合ER（人雌激素受体）的配体结构域LBD，形成Cre-ER融合蛋白，并定位于胞浆中。只有与雌激素结合后，cre酶才能被释放出来，入核发挥功能(图3)。为避免内源性雌激素的干扰，对LBD做了改造，使得Cre-ER只能结合人工合成的雌激素（如Tamoxifen等），来诱导Cre的解离，目前有Cre-ERT和Cre-ERT2两种。Cre-ERT2的敏感性更高。因此，我们可以通过控制Tamoxifen的处理时间，实现对基因重组的时间特异性调控。构建表达CreERT或CreERT2的AAV载体，可以配合flox小鼠使用Tamoxifen来做条件性敲除。

图3 他莫昔芬 (Tam) 诱导的雌激素受体系统与 Cre (CreER) 融合[1]

        Cre-loxp系统病毒依赖的基因敲除方式相比传统转基因小鼠更为灵活，且区域特异性更强，得益于AAV的特异性血清型和启动子的优势；另外极大缩短了实验周期，而转基因小鼠的建立过程非常耗时，且价格也比较昂贵。因此，使用AAV-cre病毒配合flox动物做体内基因敲除是目前的热门之选。

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参考文献：

[1] Kim H, Kim M, Im SK, Fang S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Lab Anim Res. 2018 Dec;34(4):147-159. doi: 10.5625/lar.2018.34.4.147.