免疫细胞化学(ICC)实验流程

实验概要

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

实验步骤

ICC 实验流程通常包括细胞培养与固定、通透处理、封闭、一抗孵育、二抗孵育和封片观察。

1. 固定（1) 冷甲醇、丙酮固定样品 1-10 分钟，或含 3-4% 多聚甲醛 pH 7.4 的 PBS 室温固定 15 分钟。（2) 冷 PBS 冲洗样品 3次。
2. 通透（膜蛋白不需要进行此步骤，省略）（1) 将样品在含 0.25% Triton X-100 (或 100 μM 洋地黄皂苷或 0.5% 皂角苷)的 PBS 中孵育 10 分钟。Triton X-100 是最常用的去污剂，能增强抗体的穿透力。因为它对细胞膜有损坏作用，因此不适用于与细胞膜结合的抗原。（2）确定每种目标蛋白的 Triton X-100 最佳比例。（3）PBS 冲洗细胞 3次，每次5 分钟。

3. 封闭及孵育（1）用 1% BSA、22.52 mg/mL 甘氨酸的 PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育细胞 30 分钟，封闭抗体的非特异性结合（可替代的封闭液包括 1% 明胶或来源于产生二抗的物种的 10% 血清）。（2）细胞与抗体（含 1% BSA 的 PBST 稀释）在湿盒中共同孵育，室温 1 小时，或 4 °C 过夜。（3) 弃去液体，PBS 冲洗细胞 3次，每次5 分钟。（4) 细胞与二抗在 1% BSA 中孵育，室温 1 小时，避光。（5) 弃去二抗溶液，PBS 冲洗细胞 3次，每次5 分钟，避光。
4. 复染（1) 0.1-1 μg/ml Hoechst 或 DAPI（DNA 染色剂）孵育细胞 5 分钟。（2) PBS 冲洗。
5. 封固（1) 向盖玻片上滴加一滴封固液封固。（2) 用指甲油密封盖玻片防止变干并移至显微镜下观察。（3) -20 °C 或 4 °C 避光保存。

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