奥维森科技:微生物组学测序送样指南①
生物具有维持生态系统平衡、多样性的重要功能，常用的微生物组测序手段主要是16S/ITS/18S扩增子测序和宏基因组测序。微生物组测序在农业、畜牧业、工业、医学、环境治理、生物能源等各个领域都有广泛的应用，因此涉及的样本种类繁多，不同类型样本的收集方法也各不相同。规范的收集方法以及充足的样本量是保证实验成功的第一步，因此如何正确收集和运输保存微生物样本就变得尤为重要。这里小编为大家整理归纳了微生物常见样本类型的收集流程，以供大家查阅参考！
一、DNA核酸送样建议
二、生物类样本取样方法
（一）不同类型样本建议送样量
（二）同类型样本收集流程
1、口腔
（1）口腔拭子
将拭子伸入口腔，使拭子头充分接触口腔内壁、上下牙床处粘膜、腭扁桃体、舌背面等处反复擦拭几次，收集粘膜细胞。擦拭后将拭子装回采集管（可内含生理盐水或者PBS缓冲液），做好标记后于-80℃储存。
（2）唾液
用舌尖抵住上颚或下颚齿根以富集唾液，向采集管中轻轻吐入唾液，直至液体唾液（非气泡）达到2 mL以上。将唾液4℃20000 rcf高速离心10 min，取沉淀于-80℃储存。
（3）牙菌斑
用棉卷隔湿所采集的牙齿，用无菌生理盐水冲洗牙面后用拭子、无菌挖匙或探针采集窝沟菌斑或唇颊面菌斑；或以牙线置于两邻牙之间，紧贴牙面采集邻面菌斑。样品放入采集管内于-80℃储存，注意要丢弃有出血的样品。
注意事项：
a. 取样前需了解测试者的口腔病史，并采集相应信息。
b. 取样前3个月内没有使用过抗生素，若有，请注明使用时间及种类。因为抗生素对人体菌群影响较大。
c. 取样当天身体无特殊不适症状。
d. 采样前30 min，禁食物、禁烟酒；采样时充分洗漱口腔。
2、肠道
（1）肠道内容物
将实验对象死亡处理后，无菌或较清洁环境下取出整个肠道，选取所需肠段用无菌手术刀等无菌器材采集肠道内容物。根据动物大小不同，取适量的肠道内容物。若不能立即进行提取，将内容物进行液氮速冻后储存于-80℃。
（2）肠道组织
将实验对象死亡处理后，无菌或较清洁环境下取出整个肠道，选取所需肠段置于4℃预冷Hank's液，剔除肠系膜，肠腔剪为长约3 cm小段，纵向剖开肠管，用预冷Hank's轻轻漂洗3遍，将组织进行液氮速冻后储存于-80℃。
（3）粪便
取新鲜粪便中段里部，单个个体的粪便用灭菌离心管称取样本。若不足，则根据课题需求，可将多个个体粪便样本混合为一个样品；如样本珍贵，需进行备份。采集后将粪便进行液氮速冻后储存于-80℃。
3、皮肤表面
用生理盐水浸湿的无菌棉签/拭子擦拭取样部位表面，用力使其弯曲与擦拭表面成45度，平稳而缓慢地擦拭取样表面，之后翻转棉签/拭子与前次擦拭移动方向垂直擦拭取样。取样完成后，将每个取样点的棉签/拭子头放入同一支样品收集管中，塞子塞紧密封储存于-80℃。建议取样时进行多管备份保存。
注意事项：
a. 取样前7天不能使用抗菌成分的沐浴用品。
b. 取样前24 h不能洗澡，不能使用润肤乳及抗菌活性的肥皂等。
c. 由于皮肤微生物采集比较困难，菌量可能不多，因此建议取样时进行多管备份保存，以备后续实验需求。
4、瘤胃液
（1）非胃瘘管动物
用开口器张开口器，将胃管接入吸引器，胃内容物可自行逆流至采样玻璃瓶中。用四层纱布过滤胃内容物（> 100 mL），滤液4℃ 20000 rcf高速离心10 min，取沉淀用少量生理盐水溶解后于-80℃储存。
注意事项：
不建议在动物反刍时，用手由口腔掏出食团，榨取瘤胃液。
（2）胃瘘管动物
通过瘘管实时进行瘤胃内容物取样操作。
三、环境类样本取样方法
（一）不同类型样本建议送样量
（二）不同类型样本收集流程
1、土壤
（1）土体土壤
取5-10 cm处土壤，多点采取重量相当的土壤进行混匀，去除杂质后分装到无菌离心管里，每管2-10 g，储存于-80℃。
（2）根际土壤
去除根部大块土壤，轻轻抖动植株去除附着不紧密的土壤，使用无菌毛刷等收集根部紧密附着土壤于无菌离心管中，每管3-5 g，储存于-80℃。
注意事项：
a. 选择具有代表性的土壤，随机多点取样等量混匀。
b. 所有工具及其他物品均需灭菌，或用采取的土壤擦拭。
c. 采集植株细根（具有吸收作用）部分的根际土。
d. 采集的土壤可用20目的筛子过筛，去除植物根、动物残骸以及其他杂质后分装到无菌离心管里。
e. 为防止交叉污染，不建议使用自封袋取样。
2、植物组织/内生菌
新鲜植物组织依次用70%无水乙醇浸泡40 s，再用2.5%次氯酸钠浸泡10 min（每100 mL 2.5%次氯酸钠加一滴吐温80），之后用无菌水清洗2-3次，将组织进行液氮速冻后储存于-80℃。
3、植物根、叶片表面
将植物根或叶片置于50 mL无菌离心管中，加入PBS缓冲液（1x PBS，pH7.4）后漩涡振荡，使得微生物从物体表面充分的脱落并聚集在PBS缓冲液中。缓冲液4℃ 20000 rcf高速离心10 min，取沉淀于-80℃储存。或者将缓冲液用0.22 μm孔径滤膜过滤，滤膜装入离心管中于-80℃储存。
4、水体
根据研究目的确定水体的取样深度和范围，采样后选择合适孔径的滤膜，使用水体抽滤机抽滤适当体积水体，或抽滤至滤膜上可见明显覆盖物，滤膜装入离心管中于-80℃储存。
滤膜孔径大小选择参考：细菌0.22 μm；超微浮游生物Piconanoplankton 0.8-5 μm；微型浮游微生物Nanoplankton 5-20 μm；小型浮游生物Microplankton 20-180 μm；中型浮游生物Mesoplankton 180-2000 μm。
取样体积选择参考：海水样本（深度密集型采样）20 L；海水样本（大水体量取样）200-1700 L；河水样本35 L；地下水1 L。
抽滤体积参考：扩增子项目：3-5 L水体过滤到1-2张滤膜（0.22 μm或0.45 μm孔径）；宏基因组项目：30-50 L水体过滤到1-2张滤膜（0.22 μm或0.45 μm孔径）。
注意事项：
a. 澄清水体或略浑浊水体，根据需要用0.22 μm或0.45 μm孔径的滤膜过滤，取样体积大于5 L。
b. 浑浊水体，建议先用大孔径的滤膜过滤一遍，再用小孔径的滤膜过滤。
5、活性污泥
从实验装置中取活性污泥样本（大于20 mL）于无菌离心管中，储存于-80℃。
注意事项：
因活性污泥样本体积较大，一方面储存不便，另一方面含水量高，冻融提取也比较困难，加大了实验工作量及难度，因此建议及时提取后保存DNA即可。
6、空气
用不同孔径大小的无菌滤膜筛选目的空气微颗粒，将含颗粒的滤膜装入无菌铝箔或离心管内，密封在-80℃储存。
可进一步处理：截取适量大小滤膜，置于含有PBS缓冲液（1x PBS，pH7.4）的50 mL离心管，4℃加速度离心2 h。之后温和旋涡处理，用0.22μm孔径的滤膜过滤重悬液，滤膜装入离心管中（多管备份），-80℃保存。
7、酒醅、酒糟
不破坏窑池整体密封环境条件下，使用取样器通过取样口直接插入酒醅进行取样。采集不同空间位置的酒醅、酒糟（表面层、上层、中层、下层），每层取三点或多点样本进行混匀，分装到无菌离心管里（多管备份），-80℃储存。
四、菌液/菌丝样本收集流程
1、取样容器：1.5-5 mL离心管
2、建议送样量：细菌/真菌重测序、细菌/真菌框架图菌体干重≥100 mg；细菌完成图、真菌精细图菌体干重≥300 mg
细菌/真菌菌液：取对数生长期菌液50 mL，4℃ 4000-8000 g离心10 min后弃上清，菌体沉淀用无菌水清洗2次后，收集菌体到无菌离心管中，立即用液氮速冻，储存于-80℃。
真菌菌丝：将菌丝刮入无菌离心管中后送样（不接受平板样品，注意不要刮到培养基），立即用液氮速冻，储存于-80℃。
五、样品收集、储存、寄送基本原则
（1）严格无菌操作：样品采集所用工具、收集管均需满足无菌条件，取样环境如不能满足无菌条件也应尽量清洁；
（2）取样时尽量避免样本受到干扰，尽量缩短保存和运输时间，以保证样品原始状态的微生物群落组成状态；
（3）样品收集管密封严实（封口处用封口膜封好）后储存于-80℃；
（4）送样优先选择新鲜采集的样本，其次才是冻存样本；
（5）用于DNA样品制备实验的样品前处理或切割分装过程尽可能在冰上快速进行，避免因时间过长导致样品降解；
（6）样品冻存期间，避免反复冻融；
（7）寄送时用大体积干冰运输，且要保证在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余；
（8）样品标记清晰且与样品信息单一致，管盖管身均需写上标记，自封袋建议在两个及以上的不同位置都写上标记。
以上就是小编精心梳理的微生物常见样本类型的收集流程及注意事项啦！合格的样本是准确获取样本微生物组数据和项目顺利完成的基础，因此规范的取样及送样真的很重要。我们接收样本后，如果发现任何异常，也会及时跟老师沟通并反馈样本情况。如果您对于微生物组学送样方面还有疑惑，请与小编联系，欢迎各位老师前来咨询！
