USP3通过去泛素化RLRs抑制I型干扰素信号

写在前面

        今天推荐的是由中山大学生命科学学院团队在2014年4月发表于Cell Research（IF：17.916，JCR 1区）的一篇文章，通讯是Jun Cui教授和Rong-Fu Wang教授，研究表明USP3通过去泛素化RLRs在I型IFN信号通路与抗病毒免疫中起负调控作用。

研究背景

        I型干扰素（(包括IFN-α和IFN-β)）是病毒清除的关键，严格调控I型IFN信号对于维持先天性和获得性免疫的动态平衡至关重要。泛素化的翻译后修饰在先天免疫信号的正负调控中起着关键作用。     

        RIG-I和MDA5作为胞质RNA感受器，在刺激后招募线粒体蛋白MAVS。MDA5与RIG-I具有相同的结构域，其中CARDs用于结合MAVS，而CTD用于结合dsRNA。结构分析表明，RIG-I在没有病毒RNA时通过CARD和CTD的分子内相互作用而自我抑制。RIG-I的激活需要RNA结合与K63连接的多泛素链。TRIM25和RNF135已被确定为介导RIG-I上K63-多泛素化的E3泛素连接酶。然而，对其去泛素化的分子机制仍知之甚少。

摘要部分

        去泛素酶USP3已被鉴定为一种染色质修饰物，可维持基因组的完整性，但它是否参与先天免疫信号尚不清楚。作者报道了USP3通过靶向RIG-I抑制I型IFN信号通路的激活。USP3的敲低特异性增强了RIG-I的K63-泛素化，上调了IRF3磷酸化，并促进了I型IFN细胞因子的产生和抗病毒免疫。作者进一步证明，在病毒感染或配体刺激下，USP3通过K63连接的多泛素链与RIG-I特异性结合并将其移除。作者的研究确定了USP3在RIG-I激活中的作用，并阐明了USP3抑制RIG-I信号传导和抗病毒免疫的相关机制。

研究内容

1.USP3负调控I型IFN信号   

        作者发现，USP3显著抑制了刺激诱导的IFN-β荧光素酶报告基因（IFN-β-luc）的表达。进一步研究发现，USP3显著抑制所有刺激诱导的ISRE-luc，但仅部分抑制NF-κB-luc的激活，这表明USP3直接且主要抑制IFN-β信号。     

        接着作者检测转染了Myc-USP3或内源USP3的293T细胞中IRF3的磷酸化情况，结果发现Myc标记或未标记的USP3对ISRE激活均表现出类似的抑制作用。此外，Myc-USP3明显抑制了由不同刺激诱导的内源性IRF3磷酸化。

        病毒感染的实验显示，24h后对照组有30.6％的细胞被感染，而转染USP3的细胞中高达87.6％被感染。这说明USP3的过表达导致病毒感染的细胞明显增多。

研究结论：USP3的过表达抑制I型IFN应答，从而减弱抗病毒免疫。

2.USP3的敲低促进RLR介导的抗病毒反应     

        接着作者探究USP3下调对转录因子IRF3磷酸化（p-IRF3）的影响。结果显示，在poly(I:C)和poly(dA:dT)处理或VSV感染条件下,USP3敲低的细胞中p-IRF3比对照细胞至少高了3倍。研究表明，USP3的下调显著增强了刺激后293T中IRF3的磷酸化。     

        作者发现下调USP3还显著增加了刺激后293T中ISRE-luc和NF-κB-luc的活性。与该结果一致，敲低USP3显著提高了IFN-β或IFN刺激的细胞因子（如IFIT2和CCL5）的mRNA水平。这表明USP3下调可促进IFN-β的激活和IFN诱导的基因表达。

        作者敲低了293T中的USP3，然后用VSV-eGFP感染细胞。结果发现。感染后16-24 h，USP3的敲低使细胞对病毒感染具有抵抗力，且病毒感染的细胞明显减少。

研究结论：USP3特异性的敲低显著增强了I型IFN应答和抗病毒免疫。

3.USP3通过靶向RIG-I和MDA5抑制I型IFN信号     

        作者制备了包含CARD的N端RIG-I或N端MDA5，结果发现它们可以强烈激活ISRE-luc，但增加USP3的量可以抑制这种激活，表明USP3直接抑制了RIG-I和MDA5上CARD的功能。   

        进一步的实验显示，USP3的敲低增强了RIGI（N）和MDA5（N）诱导的ISRE-luc或IFN-β-luc活性，但不能增强MAVS、TBK1或IRF3诱导的激活。

        此外，USP3的过表达抑制了RIG-1（N）或MDA5（N）诱导的IRF3磷酸化，但不能抑制MAVS或IRF3诱导的磷酸化，而USP3的敲低具有相反作用。此外，USP3可抑制RIG-I诱导的I型IFN信号，但不能抑制MAVS诱导的I型IFN信号。

研究结论：USP3通过RLRs直接抑制IRF3磷酸化和I型IFN信号。

4.配体刺激后USP3与RIG-I和MDA5相互作用     

        实验表明，USP3在未刺激的细胞中不与RIG-I相互作用，但在配体刺激后与RIG-I相互作用。同样，配体刺激后USP3与MDA5相互作用。相反，未发现USP3与其他下游信号蛋白存在相互作用。     

        作者还发现USP3在未刺激的THP-1细胞中同样不与RIG-I、MDA5相互作用。但在相应的配体刺激下，USP3可分别与RIG-I、MDA5相互作用。

        接下来作者探究在RLRs中与USP3相互作用的结构域。结果显示USP3与全长RIG-I的相互作用较弱，与RIG-I（N）的相互作用较强。MDA5的实验得到了相似结果。因此，USP3与RIG-1或MDA5中的CARD发生特异性相互作用。

研究结论：USP3以配体依赖的方式与RIG-I或MDA5相互作用，并且USP3仅在RLRs暴露出CARD时与之结合。

5.USP3介导去除RIG-I上K63连接的多泛素链     

        实验显示，poly（I:C）（LMW）刺激4-8 h后，293T中RIG-I的K63位被高度泛素化。而USP3的过表达显著抑制这一泛素化。与此一致，USP3的敲低促进了配体刺激后RIG-I上的K63-泛素化。作者还观察到过表达USP3对MDA5泛素化具有类似的抑制作用。

        另外，作者还敲除了THP-1细胞中的内源性USP3。结果显示，转染USP3 siRNA的细胞中RIG-I的K63-多泛素化水平增加，并且这种增加与IRF3的磷酸化增强相关。此外，将泛素化的RIG-1或MDA5与纯化的USP3蛋白共同孵育会降低它们的多泛素链水平。

研究结论：USP3可直接切除RLRs上K63连接的多泛素链，从而抑制IFN-β信号。

6.USP3的去泛素化活性需要锌指Ub结合域和USP催化域     

        USP3包含两个保守的蛋白质结构域：锌指Ub结合结构域(ZnF)和USP催化结构域（UCH）。作者发现，虽然USP3的ZnF结构域本身不能抑制RIG-I诱导的I型IFN激活，但UCH结构域可能需要它才能达到最大的催化活性。

        作者构建了UCH被破坏的USP3突变体（C168S）和ZnF被破坏的USP3突变体（H56A）。实验显示，USP3（C168S）和USP3（H56A）突变体均不能从RIG-I中去除K63连接的多泛素链，表明RIG-I的去泛素化需要USP3上完整的ZnF和催化结构域。作者进一步确定了上述两种突变均消除了USP3对I型IFN信号的抑制作用。

研究结论：USP3的168位半胱氨酸和56位组氨酸对于其去泛素化活性都是必不可少的。

7.USP3与泛素化的RIG-I特异性结合并切割多泛素链     

        作者发现，表达两种USP3突变体的细胞中RIG-I(N)的K63-泛素化要比表达WT USP3的细胞强得多。另外，RIG-I（N）与USP3（C168S）或USP3（H56A）的相互作用也比WT USP3的相互作用强得多。相关性表明，USP3可能仅与泛素化的RIG-I相互作用。

        作者发现RIG-1（N）的K172R或D122A突变体均不能激活下游I型IFN信号。研究表明，USP3无法与泛素化程度较弱的RIGI（K172R）相互作用。相比之下，USP3与强泛素化的RIG-1（D122A）突变体有较强的相互作用，尽管它未能激活MAVS和I型IFN信号。

研究结论：USP3特异性结合泛素化的RIG-I和MDA5蛋白并切割其上结合的多泛素链，切割完成后USP3会从这些蛋白上脱离。

结论与讨论

        研究表明USP3通过靶向RIG-I抑制I型IFN信号通路的激活。下调USP3可以特异性增强RIG-l上的K63-泛素化,上调IRF3的磷酸化，并促进I型IFN细胞因子的产生和抗病毒免疫。作者进一步证明，病毒感染或配体刺激下USP3与RLRs结合并切割多泛素链。作者的发现确定了USP3在RIG-I激活中的作用，并阐明了USP3抑制RIG-l信号转导和抗病毒免疫的相关机制。

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原文链接:https://www.nature.com/articles/cr2013170