关于真核生物DNA复制过程研究的思考

——Structural Mechanisms for Replicating DNA in Eukaryotes阅读心得

写在前面

    怎么说呢，这个系列就是把自己的homework拿出来晒一晒，也就是图一乐丢人现眼一下，因为本人能力和知识范围有限，难免会有错误，请谅解一下，也就是仅供参考。引文都有标注，如果有侵权的可以联系我。欢迎各位大佬多交流，提问题、指错误。要是能关注一波那就更好了  

1 DNA复制

DNA是生物遗传信息的载体，生命的遗传实际上是DNA自我复制的结果。因而，准确稳定的复制过程是生命延续的基础，但双链DNA的复制是一个极其复杂的过程，在复制地起始、延伸、终止三个阶段，无论是真核生物还是原核生物都需要多种酶与蛋白质的协同参与。

从Watson 和Crick 在提出DNA双螺旋结构时人类就开始了对DNA的复制过程的探索，时至今日，DNA的复制方式与复制过程已被大致明了，但更加精细的中间过程却一直未被完全阐明。近年来，结构研究方面的技术进步，特别是同步辐射源和低温电子显微镜（cryo-EM）的，使人们能够测定更大、更短暂、更复杂的结构，使DNA复制过程研究的阶段深入到原子层面。[1-2]

2 真核生物的DNA复制

2.1 DNA复制的起始

在真核生物细胞中，DNA复制仅仅是细胞周期的一部分，只在S期进行，但其起始过程的横跨两个时期：对指导复制起始的序列进行识别发生在G1期，随后的起始点激活发生在S期，这保证了每条染色体在每个细胞周期中只复制一次。由4个独立的蛋白质组成的前复制复合体pre-RC 的形成介导了复制器的选择。

首先真核生物DNA复制的起始需要起始点识别复合物（origin recognition complex,ORC）参与，ORC是杂六聚体，由6个亚基（Orc1-6）构成，其中Orc1-5共用一个相关结构。ORC具有类似原核起始蛋白的AAA+与WH（winged helix，有翼螺旋）结构域，后者具有DNA结合功能。ORC会优先结合复制起始点ARS（自主复制序列）共有基序（ACS）位点的11个碱基对（bp）序列，然后再通过AAA +域的起始蛋白特异性基序（ISM）与DNA的磷酸核糖骨架结合，WH域通过一个进入DNA大沟的β－发夹motif结合DNA。这些作用在DNA离开ORC的中央通道时使其弯曲，有助于解旋酶Mcm2-7的装载。

ORC 结合复制起始位点后，会招募两个解旋酶装载蛋白Cdc6和Cdt1，再共同募集真核复制叉解旋酶Mcm2 ～7复合体，形成pre-RC(Fig1)。之后再将CDC6和CDT1从染色质中释放出来，以防止MCM2-7重新加载，使其保持惰性，保证每个细胞周期只复制一次。在S期， CDC45和DNA复制复合物Go-Ichi-Ni-San（GINS）与MCM2-7六聚体结合形成CDC45 / MCM2-7 / GINS（CMG）复合物，激活MCM的解旋酶活性。[2-3]

2.2 DNA链的延伸

在真核生物DNA复制时，由于DNA双螺旋的反平行性质，前导链可由DNA聚合酶α与引发酶形成复合体利用dNTP延伸，进行连续合成，由于DNA聚合酶α缺乏校对能力，进一步的引物延伸由聚合酶δ主要负责，后随链与DNA复制叉前进相反方向延伸，由DNA聚合酶ε不连续合成。在产生短的冈崎片段的过程中，DNA聚合酶δ能够迁移到下游前一片段上的引物的有限部分中取代该部分，从而产生一个ssRNA片段，该片段可由核酸内切酶1（FEN1）蛋白切除。最后相邻的冈崎片段被DNA连接酶I连接。

真核复制体面临着一项挑战性的任务，即招募DAN聚合酶α、δ、ε并使其与CMG解旋酶的解旋的DNA链同步，以催化前导链和后随链合成。此外，参与稳定解旋、促进冈崎片段成熟以及与核小体去除和沉积竞争的辅助因子的活性也必须进行精细协调，以群准确地复制染色体。增殖细胞核抗原（PCNA）在复制聚合体中起至关重要的作用，PCNA最初被称为DNA滑动夹（DNA sliding clamp），认为它的作用是提高聚合酶的效率。随后的研究表明，它可与多种分子相互作用，从而参与多种代谢途径，包括DNA的复制与修复、DNA甲基化、染色质重塑和细胞周期调控等。[1-3]

2.3 DNA链的终止

真核生物在染色体的多个起始点开始DNA复制，因此复制叉在会染色体的起始点处相遇并终止。由于真核生物具有线性染色体，DNA复制无法到达染色体的最末端，造成末端缺失问题，由于这个问题，使得染色体末端的DNA在每个复制周期中都会丢失，一般由近末端的重复DNA区域－端粒防止基因丢失。[1]

3 思考与展望

  目前，虽然DNA复制过程已大致明了，但相关的酶与蛋白如何关联，如何结合，经历何种构象改变促使DNA复制过程的顺利启动与完成等问题仍然需要深入探索。随着结构研究技术的不断发展，更多结构中间体图像的不断拍摄，更多复制相关调节机制的不断阐明，我们对DNA复制过程会有更加清晰的认知。

同时，我们或许也可以关注古菌等极端微生物的DNA复制过程的与模式生物复制过程的比对，可能会发现某些独特的因素差异，用于改良体外DNA复制体系等拓展研究。

参考文献：

[1] 朱玉贤，李毅编著. 现代分子生物学[M]. 北京：高等教育出版社， 2019.06.

[2] Attali I, Botchan MR, Berger JM. Structural Mechanisms for Replicating DNA in Eukaryotes. Annu Rev Biochem. 2021 Jun 20;90:77-106. doi: 10.1146/annurev-biochem-090120-125407. Epub 2021 Mar 30. PMID: 33784179.

[3] https://zhuanlan.zhihu.com/p/105706399