免疫沉淀技术之Co-IP结果解读与分析

       上期干货中，为大家介绍了免疫共沉淀（Co-IP）的实验原理和相关实验操作步骤，这为读懂Co-IP实验结果的前提，因此本文针对Co-IP结果进行分析解读，从结果图注含义到实际案例逐一进行。

Co-IP实验结果内容解读

（1）下面是Co-IP实验结果示例图（非实际条带，仅供参考）：

                                                A                                                                                      B

图1 Co-IP结果示例图（A代表protein A和B有相互作用，B代表protein A和B之间不存在相互作用）

对结果进行分析之前，还需要了解图中的标注都是什么含义：

IP：即指免疫沉淀（immunoprecipitation），用相应的抗体来纯化富集目的蛋白，例如图中“IP: Flag”的意思是用Flag标签抗体磁珠去拉Flag，与Flag融合表达的蛋白为诱饵蛋白，此时与该融合蛋白相互作用的其他蛋白都会因此被沉淀下来。

IB：即指免疫印迹（immunoblotting）或western blot（WB），用来检测目的蛋白的存在与否，例如图中“IB: Flag”是指用Flag抗体做WB检测，看样本中是否存在Flag标记的蛋白，IB：Myc的含义同理；值得注意的是，抗体应使用兼容IP实验的。

Iuput：指阳性对照组，是进行IP前制备蛋白样本时预留下的部分样品，做WB确认目的蛋白的存在，以排除假阳性结果的干扰。

（2）实验结果图分析：

       了解结果图图注的含义后，咱们根据图1 A和图1B分析protein A和protein B的相互作用情况。protein A-Flag和protein B-Myc代表二者都融合了蛋白标签，可通过蛋白标签标记目的蛋白的存在。

①     图1中的Input组是对细胞裂解液的蛋白样本进行WB检测，采用标签蛋白Flag和Myc的抗体去验证蛋白样本中是否存在目的蛋白。图1 A和B的Input结果均表示存在两种目的蛋白。

②     IP组是用含Flag抗体的磁珠进行免疫沉淀，将得到的沉淀复合物进行WB检测，判断protein A和protein B是否存在相互作用。图1A的IP组结果显示，在第三组沉淀复合物样本中均检测到了Myc和Flag，表明protein A和protein B之间存在相互作用；图1B IP组的第三组样本中只有Flag，而没有检测到Myc，代表protein A和protein B之间不存在相互作用。

文献案例分析

       了解Co-IP结果图一般含义后，我们再结合文献案例实战分析Co-IP的结果。（案例均引自汉恒客户发表的文章）

案例一：（目的蛋白不带标签进行Co-IP验证）

图2 BRD9和FOXP1之间存在相互作用[1]

       根据结果图信息，首先从最左边的一列可以知道该结果是探讨BRD9和FOXP1之间是否存在相互作用；并且二者都没有带标签，因此IB检测直接用针对目的蛋白的抗体；然后Input组为阳性对照，IgG为IP组的阴性对照，anti-FOXP1是IP的实验组，即表示分别用IgG和FOXP1的抗体进行WB检测蛋白复合物。结果显示，Iuput组中均检测到了BRD9和FOXP1，表明样本存在这两种蛋白；IP组中的IgG组未显示条带，排除非特异性结合的可能，而anti-FOXP1组在BRD9和FOXP1的条带位置中均显示，即沉淀复合物中存在这两种蛋白，证明BRD9和FOXP1之间存在相互作用。

案例二：（目的蛋白融合标签进行Co-IP验证）

图3 UHRF2和PRDX1之间存在相互作用[2]

       作者在HepG2细胞中过表达Flag-UHRF2，验证与内源PRDX1之间的相互作用情况，以Flag-Mock为空白对照组。UHRF2融合了Flag标签，因此既可以检测Flag来证明UHRF2的存在，也可以直接检测UHRF2。同样的，从Input组的条带可知蛋白样本中存在UHRF2和PRDX1；IP中的IgG组基本未显示条带，阴性对照正常。结果B过表达Flag-UHRF2后用带Flag抗体的磁珠进行IP（第四列条带），用PRDX1抗体做WB检测，结果在PRDX1的位置出现条带，表明UHRF2和PRDX1之间存在相互作用。结果C中的IP实验组是用PRDX1抗体的磁珠去拉免疫复合物，分别用PRDX1抗体和UHRF2抗体做WB检测。结果中无论是空白对照还是UHRF2过表达，PRDX1都必然会显示条带。UHRF2在空白对照和过表达组也都显示出了条带，表明不管是内源性还是外源性过表达的UHRF2都能与PRDX1相互作用。

案例三：（通过标签标记，验证蛋白互作的同时，探讨可能的结合位点）

图4 LRP6和CTSD之间存在相互作用，且LRP6（P1427Q）和CTSD（G316R）可能是二者相互作用的位点[3]

       作者使用Flag标签标记LRP6的野生型及其两种突变体，His标签标记CTSD的野生型及其突变体，验证二者的相互作用和可能影响相互作用的位点。将LRP6的三种质粒分别与CTSD野生型质粒共转至293T细胞，另外LRP6 WT与CTSD（G316R）质粒共转，WB均使用标签抗体显示相应的目的蛋白。从Input组结果可以看出，每组均显示了条带，表明蛋白样本表达正常。接着，IP组中的各组分别用含Flag抗体的磁珠和含His抗体的磁珠去拉沉淀复合物，WB再检测Flag和His。IP: Flag结果显示，前两组中His均能检测到明显的条带，表明LRP6和CTSD之间存在相互作用，LRP6的P1427Q突变并不影响二者的互作；LRP6（P1427Q）和CTSD WT共转组、LRP6 WT和CTSD（G316R）共转组的His明显下降，说明LRP6的1427 P突变和CTSD的316 G突变会影响二者的互作。此外，IP: His的结果与之一致。因此，证明了LRP6和CTSD之间存在相互作用，且与LPR的1427 P和CTSD的316 G有关。

       总之，Co-IP实验结果分析不难，关键是熟知Co-IP的实验原理和实验步骤以及实验分组的含义，再通过例子仔细耐心地实践分析即可，希望本文能对大家阅读Co-IP实验结果有所帮助。汉恒生物专注病毒包装，可提供多种带标签的载体，欢迎联系咨询~

参考文献：

[1] Du J, Liu Y, Wu X, Sun J, Shi J, Zhang H, Zheng A, Zhou M, Jiang X. BRD9-mediated chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism. Nat Commun. 2023 Mar 14;14(1):1413. doi: 10.1038/s41467-023-37116-5.

[2] Zhang Y, Wu K, Liu Y, Sun S, Shao Y, Li Q, Sui X, Duan C. UHRF2 promotes the malignancy of hepatocellular carcinoma by PARP1 mediated autophagy. Cell Signal. 2023 Sep;109:110782. doi: 10.1016/j.cellsig.2023.110782.

[3] Wang X, Zou Y, Chen Z, Li Y, Pan L, Wang Y, Liu M, Yin C, Wu J, Yang C, Zhang L, Li C, Huang Z, Wang D, Qian J, Ge J, Zou Y, Gong H. Low-density lipoprotein receptor-related protein 6 regulates cardiomyocyte-derived paracrine signaling to ameliorate cardiac fibrosis. Theranostics. 2021 Jan 1;11(3):1249-1268. doi: 10.7150/thno.48787.