数字PCR（dPCR）是一种核酸绝对定量的技术，与传统的荧光定量PCR技术（qPCR）相比，dPCR拥有可以精确到单个核酸分子的高精准度、适合复杂样本的高便捷度、且无需标准曲线或参照基因进行对比分析等特点。因此，高灵敏度、绝对定量、高稳定性和更高的抗干扰能力成为数字PCR的4大优势。

基于下一代测序(NGS)的无创性产前检查(NIPT)在筛查胎儿非整倍体方面优于传统的血清生化检查(SBT)，具有较高的敏感性和特异性。然而，由于其高成本，它还没有被广泛用作初级筛选工具，并且更便宜的SBT仍然是初级筛选的选择，即使在灵敏度和特异性方面存在众所周知的不足。郑州大学第一附属医院妇产科遗传与产前诊断中心，报道了一种多重微滴数字PCR NIPT (dPCR-NIPT)检测法，它可以在单管反应中检测三体21、18和13 (T21、T18和T13)，其灵敏度和特异性比SBT更好，价格比NGS-NIPT便宜得多。

 

该篇文献是关于dPCR-NIPT分析的第一份报告，该分析包括从样品处理到多重dPCR扩增的所有必要试剂（包括样品处理、cffDNA组分富集、靶细胞游离DNA (cfDNA)浓度富集和dPCR扩增试剂)，可以在单管反应中检测T21、T18和T13。研究结果表明，该方法的敏感性和特异性优于SBT，而成本远低于NGS-NIPT法。因此，从检测性能和经济效益的角度来看，使用dPCR-NIPT检测代替SBT作为主要筛查工具，然后进行NGS-NIPT再筛查，将是比现有CS更好的检测母体血浆中胎儿非整倍体的方法。

   为了评估这种dPCR-NIPT分析在真实临床环境中的表现，郑州大学第一附属医院通过测试真实的临床样本来执行整个分析过程。本研究共招募了453名单胎妊娠的高危孕妇，通过医院常规的第一和/或第二孕期胎儿非整倍体筛查(包括SBT和/或超声)确定其高危状态。该人群中的一些妊娠是由他们的医生直接选择或规定进行NGS-NIPT筛查的，除了少数几个，所有通过SBT和/或超声波确定的高危妊娠都进一步通过NGS-NIPT方法重新筛查，以确认高危结果并过滤掉假阳性。NGS-NIPT高危妊娠最终由侵入性CVS/AC程序诊断。一份单独的等分试样(约2.5毫升)的每个母体血浆样品在-20℃下保存，用于该dPCR-NIPT测试。在453个样本中，随机挑选了170个(包括2个T21、1个T18和1个T13样本)用作现场训练和检测关键程序验证的训练集，以及用于建立该检测的整倍体基线临界值。剩余的283个样本(包括25个T21、10个T18和1个T13样本)作为测试集，通过dPCR-NIPT试验以盲法进行筛选。

     首先进行样本的制备，使用Qubit 3荧光计和Qubit DS DNA和BR Array Kit (Thermo Fisher，USA)测量每个分离样品（2.5ml的血浆）的cfDNA浓度，只有DNA浓度≥ 0.2 ng/μL的样品才有资格进行dPCR-NIPT分析；另外为了提高检测灵敏度，应用多重dPCR来定量21号染色体、18号染色体和13号染色体(Chr21、Chr18和Chr13)，分别用FAM、VIC和Cy5荧光团标记Chr21、Chr18和Chr13的检测探针，以区分扩增信号。在一系列评估实验后，为三条染色体(Chr21、Chr18和Chr13)中的每一条选择10组引物和探针用于该dPCR-NIPT分析。本研究中的dPCR-NIPT检测，使用了BioDigital-QING dPCR系统(中国上海小海龟科技有限公司，)，它由三个独立的仪器组成:BioDigital-QING Loader；另外对于测试集样本，从2.5毫升母体血浆中分离的cfDNA浓度相对较低，平均值和中值分别为0.36和0.34ng/ul(范围为0.20-0.87ng/ul)。因此，需要预扩增(PA)步骤来提高目标cfDNA浓度，以进行准确的CCN定量；并经过测试PA对CCN没有显著影响，因此，决定在dPCR-NIPT分析中加入PA步骤。（如下图）

总的测试结果表明，具有最少18000个液滴的dPCR-NIPT测定法具有显著的统计学能力，以95%的置信度区分非整倍体和整倍体噪声，并且容易应用于临床上筛查胎儿非整倍体的妊娠。这种分析可以在三个方面进一步改进，使用具有多个荧光检测通道和最少80000个PCR分区的dPCR系统，将血浆样品体积增加到4 mL，并不断优化测试试剂以提高准确性和减少差异。当通过等式估计时，具有至少80000个PCR分区的dPCR系统可以将测试置信度增加到99.9%。通过检测来自高危妊娠的283份血浆样品来验证该分析的临床性能，并证明dPCR-NIPT分析的灵敏度和特异性优于SBT。根据基于当前市场价格的简要成本效益分析，与现有的CS和作为一级筛查策略的NGS-NIPT相比，升级后的CS是最经济的筛查方法，其中dPCR-NIPT分析被用作初级筛查工具，随后是NGS-NIPT重新筛查，具有更高的敏感性和特异性来筛查孕妇的胎儿非整倍体。

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