转录组测序揭示植物免疫调节根部微生物组平衡以响应磷饥饿

2022 年 2 月，湖南大学于峰教授作为通讯作者，在 The EMBO Journal 杂志(IF: 11.598)在线发表了题为“”的研究论文，报道了转录因子 PHR1 通过调节 RALF-FERONIA 受体激酶途径，抑制植物免疫、招募有益微生物，进而促进植物磷吸收的分子机制。

湖南大学博士生唐静和副教授伍斗生为论文第一作者。欧易生物在本研究中承担了转录组测序及分析工作。

研究背景

磷是植物生长发育所必需的营养元素，是限制世界范围内作物产量的主要因素之一。无机磷(Pi)是植物可吸收的磷的主要形式，但在土壤中浓度很低。

植物为了应对缺磷环境、提高 Pi 吸收，常见策略包括改变根的形态和激活 Pi 饥饿相关的转运蛋白和转录调节因子，另一种策略是与一些微生物建立有益的共生关系。在磷酸盐饥饿反应(PSR)下，植物塑造根部微生物以缓解拟南芥中的 Pi 饥饿。

PHR1 是参与拟南芥 Pi 饥饿的主要转录因子，通过识别并结合 Pi 饥饿相关基因启动子位点激活这些基因的表达。PHR1 还可以负向调节由细菌表位 flg22 触发的免疫反应。但 PHR1 介导的植物免疫抑制的分子途径以及对该过程如何有利于植物缓解 Pi 饥饿的机制仍不清楚。

研究内容

本研究发现拟南芥 PHR1 直接与 RALF 基因的启动子结合，并在 Pi 饥饿条件下激活它们的表达。RALFs 反过来通过 FERONIA 抑制病原体相关分子模式 (PAMP) 触发的免疫 (PTI) 受体复合物形成，FERONIA 是一个已报道的 PTI 调节基因，其突变可增加对某些有害微生物的抵抗力。通过 PHR1-RALF-FERONIA 轴抑制免疫，招募特定根际微生物群定殖并通过上调 Pi 转运基因的表达来帮助植物缓解低磷胁迫。本研究为环境扰动后通过调节植物先天免疫来协调宿主-微生物的平衡提供了一个新的范例。

研究结果

RALF-FER 参与低 Pi 胁迫介导的植物免疫抑制

RT-PCR 和 WB 实验结果显示，在 Pi 饥饿条件下，拟南芥根中一系列免疫指标均受到持续抑制。已有研究表明，FER 基因参与植物免疫调节。与野生型相比，在 Pi 饥饿条件下，突变体根系中免疫抑制几乎消失（图 A-C），表明 FER 是 Pi 饥饿介导的根系免疫抑制所必需的。

FER 是 RALF 的受体，FER 和 RALF23 的结合会抑制由 PAMP 触发的植物免疫反应。转录组测序结果显示，外源施加 1μM RALF23 处理，会引起与 Pi 饥饿相似的免疫基因表达谱改变（图 D-E）。进一步的 RALF23 过表达实验证实（图F-G），RALF23-FER 复合体参与了 Pi 饥饿引起的免疫抑制。

图 | RALF-FER 参与低 Pi 胁迫介导的植物免疫抑制

PHR1 在 Pi 饥饿条件下靶向并激活 RALF 表达

WB 检测显示，在 Pi 饥饿条件下幼苗中 RALF23 成熟肽的蛋白含量显著高于富磷条件下的幼苗，表明 Pi 饥饿可以促进 RALF23 成熟肽的积累（图 A）。Pi 饥饿同样可以促进其他 基因的表达（图 B-C）。 基因启动子中都含有 PHR1 的结合位点 P1BS（图 D）。 突变体中  表达大都出现显著下调（图 E）。荧光素酶报告实验、ChIP-qPCR、EMSA 证实 PHR1 可以直接结合到 RALF 启动子中的 P1BS 位点（图 F-G）。以上结果表明 PHR1 可以直接靶向并激活  的表达。

图 | PHR1 在 Pi 饥饿条件下靶向并激活 RALF 表达

PHR1 介导 RALF 激活通过抑制 FLS2-BAK1 复合体的形成以抑制 Pi 饥饿期的免疫

已有研究表明，RALF23 通过破坏 flg22 诱导的 FLS2-BAK1 复合体形成以抑制免疫反应。免疫共沉淀结果显示，与野生型相比，Pi 饥饿条件下  突变体中 flg22 诱导的 FLS2-BAK1复合物并未降低（图 B-C），表明 PHR1 是 Pi 饥饿介导的免疫复合物抑制所必需的。

Pi 饥饿条件下 突变体中 flg22 诱导的 FLS2-BAK1复合物形成可被外源施加 RALF 抑制（图 D-E）。而与野生型相比，无论富磷还是低磷条件下， 突变体中 flg22 诱导的 FLS2-BAK1复合物形成抑制均有明显减轻（图 F）。与野生型相比，在低磷条件下， 和突变体中均出现明显免疫抑制（图 G）。

以上结果表明，Pi 饥饿条件下 PHR1 通过激活 RALF 表达来抑制 PAMP 触发的 FLS2-BAK1 复合物的形成，从而抑制植物免疫反应。

图 | PHR1 介导 RALF 激活通过抑制 FLS2-BAK1 复合体的形成以抑制 Pi 饥饿期的免疫

低磷和 RALF23 处理促进根际细菌的定殖以协助植物抵抗低磷胁迫

培养 3 周后，对根际微生物群落组成进行检测，结果显示某些特定细菌的相对含量在低磷胁迫的野生型植株根际出现了明显富集（图 A, C, E, G）；同样外源施加 RALF23 处理也可以富集与低磷处理相似的细菌类群（图 B, D, F, H）；而  和  突变体中并未有明显富集。表明 FER 和 PHR1 对于低磷条件下根际微生物群落结构起着关键作用。

图 | 低磷胁迫后细菌定殖分析及 处理后 RALF23 的释放

进一步针对上述富集的细菌种类（以DC3000和  为代表）进行接种实验，结果显示，接种这 2 种细菌可以显著增加野生型和 突变体的鲜重（图 A-B），并上调根中 Pi 吸收相关基因的表达（图 C）；但  突变体中并未观测到此类现象。

以上结果表明，低磷和 RALF23 处理塑造了一种缓解 Pi 饥饿的特殊微生物群，而这种特殊微生物群用于缓解 Pi 饥饿的一种可能策略是诱导 Pi 吸收基因的表达。

图 | 细菌定殖可以缓解低磷压力

突变体的根际微生物缓解了 Pi 饥饿

微生物多样性测序显示， 突变体与低磷处理的野生型，其富集根际微生物存在大量重叠（图 A）。收集 3 周龄 突变体植株的根际微生物，接种到野生型和 突变体植株，可以显著促进其生长（图 B-C），表明 FER 的突变提供了一个有利于缓解 Pi 饥饿的根际微生物组。同时 qPCR 检测显示， 突变体植株的根际微生物接种可以显著上调 Pi 饥饿相关基因的表达（图 D）。以上结果表明， 微生物组可以缓解 Pi 饥饿并诱导 Pi 饥饿相关基因的表达。

图 |  根际微生物群在低磷条件下促进植株的生长

研究结论

本研究确定了一条 PHR1-RALFs-FER 通路，在拟南芥的 Pi 饥饿期间塑造根际微生物群。

本研究发现，协调 Pi 饥饿和免疫的关键转录调节因子 PHR1，可以在低磷条件下直接靶向并激活几个 RALF 基因的表达。PHR1 介导的 RALF 激活通过以 FER 依赖的方式抑制 PAMP 触发的 FLS2-BAK1 复合物的形成来抑制植物免疫。在 Pi 饥饿期间抑制植物免疫有助于某些根际微生物的定殖，激活 Pi 转运基因表达，缓解 Pi 饥饿。此外，来自 fer-4 突变体的微生物群显著促进了植物生长，缓解了 Pi 饥饿。

总之，本研究揭示 PHR1-RALFs/FER-FLS2/BAK1一条新的信号通路，植物利用它来抑制免疫，塑造特定的根际微生物群，并缓解低磷条件下的 Pi 饥饿。

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