【耀析漫谈】生物大分子质量分析系列2-高分辨质谱在寡聚核苷酸药物质量研究方面的应用

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前言

新冠疫情爆发后，核酸药物成为医药领域的研发热点，高分辨液质联用设备在核酸制品质量研究方面的应用很广，之前耀海生物陆续分享过其在mRNA加帽、加尾及Sequence Mapping方面的文章，有需要的小伙伴可以看回顾。

本次主要集中介绍高分辨质谱设备在寡聚核苷酸类药物质量研究方面的应用。寡核苷酸药物分为反义核酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、小激活RNA（saRNA）、适配体（aptamer）等。当前研究资源主要集中反义核酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA）药物两个方面，通常是由人工合成的长度50个以内核苷酸组成的一类药物，包含单链或双链DNA或RNA。通常靶向mRNA，从转录后水平进行治疗，具有特异性好、有效性强和长效性突出的优势。

为了保证产品的安全性和有效性，寡核苷酸药物通常需要从分子量、碱基序列、解链温度Tm、产品纯度、有关物质等方面进行分析，其中分子量、碱基序列及有关物质等均是其重要的产品属性，常用的检测方法是质谱法。目前在寡核苷酸药物表征方面使用的质谱范畴很广，低分辨质谱及高分辨质谱均有案例，其中高分辨质谱主要集中在寡核苷酸药物的高分辨分子量、碱基序列及药物代谢的分析。寡核苷酸药物极性较大，具有强烈的负电性，在常规的反相色谱条件下保留较弱，需要在流动相中添加离子对试剂1。自1997年六氟异丙醇HFIP被提出可以作为质谱的酸性修饰剂使用后，其常与三乙胺TEA一起作为流动相对寡核苷酸药物进行分析，如已上市的寡核苷酸药物米泊美生(Mipomersen)，Sun等2将其作为锁核酸(lockednucleicacid，LNA)米泊美生修饰的寡核苷酸模型，并开发了离子对反相液相色谱-高分辨质谱联用的方法对大鼠血浆中的寡核苷酸进行定量。通过优化TEA和HFIP离子对试剂的浓度会明显改善目标物的色谱峰型，但随着HFIP浓度的增加会导致离子抑制效应增强，对检测的灵敏度产生不利的影响。2020年Goyon等3通过离子对反相色谱法和含有TEA和HFIP的流动相进行硫代磷酸酯寡核苷酸纯度和杂质分布的测定，也发现TEA会影响质谱检测的灵敏度，同时由于HFIP的腐蚀性和离子抑制作用会影响质谱测定方法的耐用性，研究者们开始寻找离子对试剂的替代品。目前较常用的混合离子对试剂主要包括三乙基乙酸铵(TEAA)、三乙胺-六氟异丙醇(TEA-HFIP)、三乙胺/丙胺-乙酸盐(TEA/PA-AA)以及N-乙基二异丙胺-六氟异丙醇（DIPEA-HFIP）等，不同离子对试剂体系下寡聚核苷酸的分离情况见图1，使用超高效液相色谱仪器，6种不同的离子对试剂体系，均可以在7min的快速梯度下，对于寡核苷酸类物质实现单一碱基的分离。研究人员根据不同的分析需求，在方法开发时会对不同的混合离子对试剂及不同的浓度配比进行优化，以便于既能满足测试需求，又能减轻因为使用离子对试剂对高分辨质谱本身所造成的不利影响。

另外研究人员们也尝试使用其他的色谱模式取代离子对反相，其中亲水作用色谱HILIC的应用也并不少见。2021年Huang等5建立了HILIC-MS/MS的方法，对未修饰和完全硫代修饰的DNA寡核苷酸混合物及其合成的3'外切酶消化代谢物进行了高效分离，而后通过靶向选择离子监测(TSIM)系统分析了硫代寡核苷酸，灵敏度达13 ng(相当于2.0 pmol)。在检测灵敏度方面基本可以与离子对反相相媲美，但因离子对反相色谱在选择性分离相差1个碱基的ASO的代谢物方面优于亲水相互作用色谱6，故目前针对与寡核苷酸药物的分子量、序列及药物代谢方面，多数研究者更倾向于选择离子对反相与高分辨质谱串联，该方法具有分离选择性好、分析时间短、样品用量少和溶剂消耗少等优势。

参考文献：

1.  YANG H M，FAN H H，et al．［J］．Chin J Bio-chem Pharm，2015，35(7):161-164．

2. SUN Y，NITTA S I，SAITO K，et al．［J］．Bioanalysis，2020，12(24):1739-1756．

3. GOYON A，ZHANG K，et al.［J］．Anal Chem，2020，92(8):5944-5951．

4. Pourshahian S. [J]. Mass Spectrometry Reviews, 2019.

5. HUANG M，XU X，QIU H，et al．［J］．J Chroma，A，2021，1648:462184

6. KILANOWSKA A，NUCKOWSKIL，STUDZIN SKA S，et al．［J］．Anal Bioanal Chem，2020，412(27):7453-7467．

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