项目文章丨纯生信文章思路推荐-看单细胞测序如何助力帕金森疾病中T细胞的研究

2021年，来自哈尔滨工业大学生命科学与技术学院的蒋庆华教授团队在 Cell Discovery 杂志上发表了题名为“Single-cell transcriptome and TCR profiling reveal activated and expanded T cell populations in Parkinson’s disease”的研究论文，该研究通过单细胞转录组技术结合单细胞免疫组库测序等技术，探索了帕金森（PD）患者血液和脑脊液中 T 细胞的组成、功能和谱系的关系，该研究为探索 PD 的基本特征和潜在指导有效免疫治疗提供了依据。该研究中的单细胞转录组、单细胞免疫组库测序服务由博奥晶典提供。

【发表期刊】Cell Discovery

【影响因子】10.481

【检测技术】单细胞转录组测序、单细胞免疫组库

研究背景

研究表明，免疫系统功能障碍在帕金森（PD）的发病机制中起重要作用。这种复杂的疾病可能源于自身免疫，尽管有大量的文献报道，目前仍有许多问题未得到解答。一方面，一些研究报告了 PD 患者外周血T细胞百分比的改变，但每种细胞亚型对疾病的相对贡献仍不清楚。另一方面，在死后的人类 PD 标本和 PD 小鼠模型中，CD8+T 和 CD4+T 细胞均被报道侵入大脑，但人类外周血和脑脊液中 T 细胞亚型的组成和相互作用以及它们渗透中枢神经系统的潜在能力尚不清楚。

研究路线

研究结果

1. PD 患者和健康对照中 T 细胞的单细胞转录组和 TCR 测序研究者从 6 名健康对照和 8 名 PD 患者中采集新鲜血液样本，通过流式细胞术对 T 细胞进行分选，在 10x Genomics 平台进行 5' 基因表达和 V(D)J 文库的构建。从公开的数据库中下载了另外 7 名健康对照的单细胞数据集。此外，研究者还下载了用于挖掘 CSF 的单细胞免疫分析数据集，其中包括 6 名 PD 患者和 9 名健康对照。共获得 103,365 个 T 细胞的单细胞转录组数据和 113,690 个 T 细胞的单细胞 TCR 测序数据，其中 84,384 个细胞同时具有基因表达和 TCR 分析数据。

2. T 细胞在 PD 中表现出特定的组成和转录组

作者将 T 细胞聚类为 21 个亚群，并注释了 5 种主要的细胞类型，包括 CD8+T 细胞（CD8）、CD4+T 细胞（CD4）、黏膜相关不变T细胞（MAIT）、γδT 细胞（gdT）和双阴性 T 细胞（DNT）。接下来作者分别对几种 T 细胞进行了描述。首先是 CD4+T 细胞，3 群为幼稚 CD4+T 细胞，5 群为中央记忆 CD4+T 细胞，1 群为细胞毒性 CD4+T 细胞，2 群为高表达 Treg 标志物的 CD4+T 细胞；对于 CD8+T 细胞，1 群为幼稚 CD8+T 细胞，2 群为终末效应 CD8+T 细胞，1 群为过渡性 CD8+T 细胞，1 群中央记忆 CD8+T 细胞；作者同样对其他 3 个亚型的 T 细胞进行了描述。接下来，作者比较了 PD 患者和健康对照血液中 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞的比例，发现 PD 患者血液中的 CD8+T 细胞比例增加而 CD4+T 细胞比例降低，CD4/CD8 的比例降低（1.66），而研究报道这一比率约为 2:1，说明 PD 中可能存在免疫紊乱。

3. PD患者血液和脑脊液中克隆扩增的T细胞

为了深入了解 PD 患者中 T 细胞的克隆扩增，作者对来自 PD 患者和健康对照的 scTCR-seq 数据进行了比较分析，从单细胞 TCR 数据中检测到了 113,690 个细胞，形成 87,832 个独特的克隆型，其中 4458 个克隆型包含至少两个细胞，表明了 T 细胞的克隆扩增。通过比较分析，作者发现 PD 患者血液中的 T 细胞多样性降低，具有相同克隆大小的克隆型数量增加，说明 PD 患者血液中存在 T 细胞克隆扩增。作者又比较分析了脑脊液中的情况，发现 T 细胞的克隆扩增同样发生在 PD 患者的脑脊液中。那么克隆扩增的 T 细胞在细胞群中的分布如何？通过比较分析，作者发现克隆扩增的 T 细胞广泛分布于每个细胞群中，特别是 CD8+T 细胞。PD 患者血液中克隆大小≥2和≥100的 T 细胞百分比明显高于健康对照组。作者还发现，scTCR-seq 中未检测到 αβTCR 的 T 细胞主要是 Vd2 gd T 细胞，而仅包含一个细胞的克隆型主要是幼稚 CD4+T 细胞，较大的克隆型表现出细胞类型的不均匀分布，且主要富集在过渡和终末效应 CD8+T 细胞中。

4. PD 中 CD8+T 的克隆连锁形成转录状态梯度

作者深入分析了 PD 患者和健康对照的 CD8+ T 细胞，发现了不同亚群的 CD8+T 细胞表现出不均匀的功能状态分布，PD 患者血液中出现终末效应 CD8+T 细胞的富集和幼稚 CD8+T 细胞的耗竭。PD 患者中克隆扩增的 T 细胞在过渡和终末效应 CD8+T 细胞中显着富集。为了进一步探索 CD8+T 细胞群之间的关系，作者通过扩散图在伪时间轨迹上可视化这些细胞，结果发现第一个扩散成分将中央记忆细胞与活化的 CD8+T 细胞分离，并与细胞毒性相关基因以及调节细胞迁移和粘附分子高度相关。第二个扩散成分显示了终末效应 CD8+T 细胞两个不同的分化方向，上分支与细胞粘附蛋白及组织驻留 T 细胞转录调节相关，下分支与杀伤样受体（如 KLRC3 和 KLRF1）以及杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR2DL3 和 KIR3DL2）相关。
为了进一步探索终末效应 CD8+T 细胞之间的功能差异，作者分析了上下分化分支（C6 和 C11）之间的差异表达基因，KEGG 分析显示，C6 可能与组织免疫有关，而 C11 富含自然杀伤细胞介导的细胞毒性途径高表达基因。此外，作者还发现，PD 患者血液中的 CD8+T 细胞比例随着分化过程逐渐增加，尤其是上分化支。PD 患者血液中出现从中央记忆 CD8+T 细胞（C15）向过渡性 CD8+T 细胞（C3）转化为终末效应 CD8+T 细胞（C6）的轨迹，共享相同 TCR 的 T 细胞克隆型分布进一步支持了这种转化。通过分析 T 细胞克隆型和转录表型，作者发现 TCRs 可能参与 PD 中 CD8+T 细胞的分化。总之，这些结果揭示了一个独特的终末效应 CD8+T 细胞（C6），在 PD 患者中通过 TCR 激活表现出明显的克隆扩增和细胞毒性分化，并通过表达与细胞粘附、迁移、存活和细胞毒性有关的多个基因来区分。

5. PD 中细胞毒性 CD4+T 细胞的显著克隆扩增

该研究注释了 8 种主要的 CD4+T 细胞。作者发现 PD 患者和健康对照之间的 CD4+T 细胞的亚型组成上没有明显差异。接下来作者通过 R 包 Monocle 2 分析了几种 CD4+T 细胞之间的轨迹。发现了从中央记忆 T 细胞向效应 T 细胞再转化为 CD4 CTL 的过程。调节性 CD4+T 细胞（Treg）位于不同的分支中，较大的克隆型位于分支的末端。

为了深入了解 CD4+T 细胞之间的克隆关系，作者使用 Fisher 精确检验来识别 PD 特异性克隆扩增的 CD4+T 细胞群，发现 PD 患者血液中的 Th1 细胞和 CD4 CTL 中克隆扩增的 CD4+T 细胞显着增加。CD4 CTL 在 PD 患者中具有较大的克隆型。作者又通过扩散图进一步可视化 Tcm、Th1、Th2 和 CD4 CTL 之间的关系。发现 Th1 和 Th2 细胞均起源于 Tcm 细胞，开始平行分化。然后分化轨迹分离，部分 Th1 细胞最终转化为 CD4 CTLs。作者还发现较大的克隆型倾向于分布在 CTL 分支的末端，作者结合 TCR 的数据综合表明来自 TCR 激活的 Th1 细胞的 CD4 CTL 在 PD 患者中显著克隆扩增。

Th1 细胞可通过释放 IFNγ 对多巴胺能神经元产生细胞毒作用，从而激活和招募其他免疫细胞以放大局部炎症。也有报道称，CD4+T 细胞介导的多巴胺能毒性不需要在 PD 小鼠模型中表达 IFNγ，这表明中枢神经系统中存在细胞毒性 CD4+T 细胞浸润。该研究表明，PD 患者血液中的 TCR 依赖性激活使 Th1 和 CD4 CTL 均显着克隆扩增，这说明血液中的这两种细胞类型可能是中枢浸润 CD4+T 细胞的来源。所以，直接或间接靶向这些T细胞类型的抑制剂可通过阻止 T 细胞增殖来阻断 PD 患者的免疫反应。

6. PD 中的抗原特异性 T 细胞和候选抗原表位

作者使用了一种专为处理大量 TCR 聚类而设计的超快算法 iSMART，检测出 1778 个 TCR 特异性组。为了鉴定 PD 中的特异性 TCR，作者筛选了 67 个 TCR 特异性组，其中至少 1 个 TCR 来自血液，1 个 TCR 来自 PD 患者的 CSF。PD 特异性 TCR 的鉴定能够进一步揭示 PD 相关蛋白（如 α-syn）的候选抗原表位。作者使用了几个步骤来寻找 PD 特异性 TCR 和潜在抗原表位之间的关系。首先，从 8 名 PD 患者的全基因组测序数据中获得高分辨率 HLA 分型。其次，以 α-synuclein 和 mitochondrial 为关键词搜索 NCBI 蛋白质数据库，获得所有的 α-syn 和线粒体蛋白质序列。然后分别预测它们与 MHC I 和 MHC II 等位基因的结合亲和力。最后，使用 MHC 基因和 TCR 共享的样本来构建 MHC 肽和 TCR 之间的关系。在 14 个 TCR 特异性组和 11 个 HLA 等位基因之间发现了相对强的样本共享关系。预计这些 HLA 等位基因将与至少一种来自 α-syn 或线粒体蛋白的肽结合。作者预测的两种肽“KTKEGVLYVGSKTKE”和“GKTKEGVLYVGSKTK”可驱动 PD 患者的辅助性和细胞毒性 T 细胞反应。综上，作者利用 TCR 聚类和机器学习筛选了一组 PD 特异性 TCR 及其候选表位，为血液和脑脊液 T 细胞参与神经元变性提供了潜在的靶点。

7. PD 中细胞毒性 T 细胞通过 BBB 的可能机制

血脑屏障 (BBB) 是由内皮细胞形成的物理屏障，可防止血液蛋白、抗体和免疫细胞渗入脑实质，然而，在慢性炎症的持续作用下，内皮细胞之间的紧密连接被削弱或破坏，从而允许抗体或免疫细胞通过。作者评估了许多与细胞迁移和粘附相关的分子，发现许多与 BBB 穿透相关的分子在细胞毒性 T 细胞中高度表达。整合素家族基因（VLA-4、LFA-1、Mac-1）在过渡性 CD8+T 细胞（C3）、终末效应 CD8+T 细胞（C6、C11 簇）和 CD4 CTL（C13 簇）中表现出相对高的表达。其他细胞趋化因子、粘附分子及其受体，也在这些细胞毒性 T 细胞中广泛高表达。白细胞跨内皮迁移途径的相关基因在 PD 患者中也显着上调，这可能是细胞毒性 T 细胞通过 PD BBB 的一种机制。

研究结论

鉴于帕金森病的慢性炎症性质，T 细胞免疫在疾病发展中扮演重要角色。该研究通过单细胞转录组和 TCR 测序系统地描述了 PD 患者血液和脑脊液中 T 细胞的组成、功能和谱系关系。从 103,365 个 T 细胞中鉴定出 21 个具有不同功能的 T 细胞亚群。单细胞基因表达和 TCR 的综合分析揭示了这些亚型的连接性和潜在分化轨迹，并提供了 PD 患者血液和脑脊液中 T 淋巴细胞克隆性扩增的新证据。这一前所未有的大规模 T 细胞转录组和免疫图谱数据可作为研究 PD 基本特征和潜在指导有效免疫治疗策略的宝贵资源。

参考文献

Wang P, Yao L, Luo M, et al. Single-cell transcriptome and TCR profiling reveal activated and expanded T cell populations in Parkinson's disease. Cell Discov 2021;7(1):52.