祝贺！一个项目四篇产出，揭示缺镁胁迫对不同砧木‘纽荷尔’脐橙果实酚类物质及氨基酸
第1篇
联合代谢组学和转录组学分析揭示了两种砧木嫁接对'纽荷尔'脐橙果皮中酚酸调控机制的影响
期刊：Scientia Horticulturae
发表时间：2023年9月
单位：四川农业大学
2023年8月，四川农业大学园艺学院在Scientia Horticulturae发表了题为“Combined metabolomic and transcriptomic analysis reveals variation in phenolic acids and regulatory networks in the peel of sweet orange ’Newhall’(C. sinensis) after grafting onto two different rootstocks”的研究论文。该研究利用代谢组和转录组分析比较了嫁接对“纽荷尔”脐橙果皮酚酸生物合成的影响，为柑橘果皮的有效利用提供了有价值的信息。迈维代谢提供了广泛靶向代谢组和转录组检测服务。
研究背景
“纽荷尔”脐橙属于柑橘类水果，是全球消费最广泛的水果之一。由于新鲜食品的消费占主导地位，废弃的果皮不仅造成环境污染，而且造成宝贵资源的浪费。大量研究表明，柑橘果皮富含有益化合物，其中酚酸具有抗氧化等重要功效，柑橘果皮中酚酸生物合成的分子机制的理论研究较少，且不同砧木嫁接对酚酸生物合成的影响尚不清楚。
研究材料
选择四川省凉山彝族自治州雷波县金沙江河谷的脐橙果园作为实验果园，试验树分别为嫁接在枳壳（ct）和香橙（cj）砧上的13年生“纽荷尔”脐橙树。采集4个物候期（8月(ct1, cj1)、9月(ct2, cj2)、10月和11月(ct3, cj3)）果实。从每株树的东南和西北方向，离地面1米左右，采集大小均匀、无病虫害的果实。每个时期、每个处理分别选择3株树，每株树采集4个果实（共12个果实）作为一个生物学重复，每个组三个生物学重复。将果皮与果肉分离，再用剪刀将果皮切成1mm的块状供后续使用。
研究思路
研究结果
作者首先评估了两种嫁接方式下的4个时期果皮样品（8月、9月、10月和11月）中的总酚酸含量。结果发现“纽荷尔”脐橙果皮的总酚酸含量受嫁接砧木和果实发育阶段的显著影响。ct在9月达到峰值(3427.27µg⋅g−1 FW)， cj在8月达到峰值(316.80µg⋅g−1 FW)，ct和cj的总酚酸含量变化趋势完全相反。在10月份，虽然ct和cj之间存在差异，但差异小于其他三个时期，因此作者选择8月，9月和11月进行代谢组学分析。总共在18个样本中检测到270种酚酸，OPLS-DA结果显示ct1与cj1、ct2与cj2、ct3与cj3之间存在显著差异。利用Upset图分析筛选出受时期影响的三种酚酸，此外，ct1与cj1共有12种酚酸，ct2与cj2共有47种酚酸，ct3与cj3共有14种酚酸。
代谢组数据分析和代谢物鉴定。(A) ct1与cj1、ct2与cj2、ct3与cj3的OPLS-DA图；(B)组内相关性图；(C)Upset图；(D) 韦恩图
作者利用FC > 2 or < 0.5, p-value < 0.05 和 VIP>1进行各比较组中差异酚酸筛选。在ct1 vs cj1之间2种酚酸上调，3种下调。ct2 vs cj2中3种酚酸上调，10种下调。ct3 vs cj3中6种上调，6种下调。其中一种酚酸(3,4,5-Trimethoxycinnamic acid)在三个比较组中共有。4种酚酸（1-O-Galloyl-2-O-p-Coumaroyl-β-D-glucose, 4-O-(3 ′ -O-alpha-D-Glucopyranosyl)caffeoylquinic acid, 3-O-p-Coumaroylshikimic acid 和 Dunalianoside A）在两个比较组之间共有。进一步分析五种酚酸的相对含量。在cj1中未检出3,4,5-Trimethoxycinnamic acid，而在ct1中含量较高。同样，在ct3中未检测到1-O-Galloyl-2-O-p-Coumaroyl-β-D-glucose。4-O-(3 ′ -O-alpha-D-Glucopyranosyl) caffeoylquinic acid 和 3-O-p-Coumaroylshikimic acid的变化趋势与总酚酸含量在ct和cj之间的变化趋势一致。这24种差异累积的酚酸可能是ct和cj之间总酚酸含量显著差异的原因。
ct和cj果皮中酚酸的差异分析。(A-C) 差异条形图；(D) 4种酚酸在ct和cj之间不同发育阶段相对含量的Log2值柱形图
转录组结果表明，8 ~ 11月差异基因总数最多，分别为ct (ct1 vs ct3) 5932个和cj (cj1 vs cj3) 4741个。其中，8 - 9月ct和cj之间差异基因数105个(3741和3636)，8 - 11月差异基因数1191个(5932和4741)，9 - 11月差异基因数1608个(3621和2013)。这些结果表明，不同的发育阶段和砧木嫁接对基因表达水平有影响。在所有差异基因中，鉴定出36个富集酚酸生物合成途径的结构基因，包括4个CsPALs、2个CsC4Hs、6个Cs4CLs、8个CsCSEs、8个CsCOMTs和8个CsHSTs。利用热图分析这36个结构基因的基因表达水平。在4个CsPALs家族成员中，3个CsPALs表现出相似的基因表达水平，而一个CsPAL (Cs_ont_7g006400)表现出显著差异，该基因在cj1中的表达高于ct1，但在ct2和ct3中的表达分别高于cj2和cj3。这与总酚酸含量的变化趋势一致。此外，7个结构基因（Cs_ont_9g025750, Cs_ont_1g004990, Cs_ont_3g008120, Cs_ont_5g017430, novel.756, Cs_ont_6g004010, Cs_ont_7g004590）与总酚酸含量在ct和cj 3个不同时期的变化趋势保持一致。
酚酸合成途径及结构基因表达量热图
为了研究砧木嫁接对酚酸生物合成的影响，作者计算了24种不同的酚酸与36个结构基因之间的相关性。在ct1 vs cj1中，5种酚酸与31个基因表现出很强的相关性。在ct2 vs cj2中，13种酚酸与20个结构基因显著相关。在ct3 vs cj3中，12种酚酸与26个结构基因显著相关。这24种差异酚酸其中4种（ct1 vs cj1），10种（ct2 vs cj2），6种（ct3 vs cj3）表现出与总酚酸含量相同的变化趋势。其中，2,5-Dibenzoylglucaric acid仅与两个结构基因呈正相关，而sinapoylglucuronic acid和3-O-p-Coumaroylshikimic acid与大多数结构基因的表达水平呈正相关，其中包括一个CsPAL基因和一个Cs4CL基因。在cj中鉴定了33个与酚酸合成密切相关的结构基因。对ct和cj进行了三个时期的两两比较，以确定调节酚酸生物合成的转录因子。在六个比较组(ct1 vs ct2, ct1 vs ct3, ct2 vs ct3, cj1 vs cj2, cj1 vs cj3, cj2 vs cj3)中分别鉴定了228、378、227、269、325和125个差异转录因子。对ct1 vs ct3中378个TF的前5位家族成员进行分析，结果发现AP2/ERF-ERF家族成员最多，其次是bHLHs、MYBs、NACs和WRKYs，共有134个TFs。在cj1 vs cj3中，下调的转录因子数量也高于上调的转录因子数量。这与cj1 vs cj3总酚酸含量的趋势一致。进一步对325个转录因子进行了分类，发现前5个转录因子家族占转录因子总数的36%。转录因子成员数量最多的家族仍然是AP2/ERF-ERF。其余4个家族分别为GRASs、C2H2s、NACs和bHLHs。此外，ct2 vs ct3中差异转录因子的数量远高于cj2 vs cj3。在ct1 vs cj1中，筛选出54个差异转录因子，其中AP2/ERF-ERF 12个，其次是MYBs(5个)和NACs(5个)家族成员。在ct2与cj2中，鉴定出67个转录因子，差异转录因子数量最多的家族也是AP2/ERF-ERFs(16个)，其次是C2H2s(7个)、NACs(6个)和LOBs(6个)。在ct3与cj3中，鉴定出99个差异转录因子，AP2/ERF-ERFs(17个)，其次是MYBs(13个)、bHLHs(8个)、C2C2-Dofs(7个)和WRKYs(6个)家族。
不同酚酸与结构基因的关系图。(A) ct1与cj1、ct2与cj2、ct3与cj3的和弦图；(B)不同酚酸相对含量的Log2值柱形图
通过共表达网络来确定酚酸生物合成的调控机制。在ct1和cj1中共表达了5种酚酸和54种TFs，发现了9个AP2/ERF-ERF家族成员和5个MYB家族成员。其中，3-O-p-Coumaroyl shikimic acid，1-O-Galloyl-2-O-p-Coumaroyl-β-D-glucose，(3-Mustard acyl)-fructosyl- α -D-(6-mustard acyl)gluco-side与4个转录因子ERF23、EF109、ERF14和MY102呈显著正相关，与2-Feruloyl-sn-glycerol，3,4,5-Trimethoxycinnamic acid.呈显著负相关。8个MYB和1个AP2/ERF-ERF家族成员与2-Feruloyl-sn-glycerol和3,4,5-Trimethoxy-cinnamic acid呈显著正相关，与3-O-p-Coumaroylshikimic acid，1-O-Galloyl-2-O-p-Coumaroyl-β-D-glucose，(3-Mustard acyl)-fructosyl-α-D-(6-mustard acyl)glucoside呈显著负相关。此外，作者对ct2和cj2进行了相同的分析，发现12个AP2/ERF-ERF家族成员和3个MYB与13种差异酚酸显著相关。在ct3与cj3的共表达中，发现11个AP2/ERF-ERF家族成员和13个MYB家族成员与12种差异酚酸显著相关。这24个差异转录因子被分为两类，其中6个差异转录因子与6种差异酚酸呈正相关。其余7个MYB和10个AP2/ERF-ERF家族成员与6种差异酚酸正相关。筛选与发育时间相关的转录因子，59个差异转录因子存在于ct的所有时期，36个差异转录因子存在于cj的三个时期。在ct和cj中存在3个共有差异酚酸与转录因子显著相关。这些转录因子可能是影响酚酸差异合成的潜在转录因子。为了验证转录数据的可用性，随机选择了20个基因进行qRT-PCR分析。结果显示，大部分基因的相对表达水平与转录组结果一致，证明了转录组数据的准确性。
“纽荷尔”脐橙果皮酚酸生物合成的假设模型图
第2篇
结合代谢组学和转录组学分析嫁接对'纽荷尔'脐橙果皮中类黄酮生物合成的影响
期刊：frontiers in plant science
发表时间：2023年7月
单位：四川农业大学
2023年7月，四川农业大学园艺学院在frontiers in plant science发表了题为“Hetero-grafting affects flavonoid biosynthesis in sweet orange 'Newhall' (Citrus sinensis) peels: a metabolomics and transcriptomics analysis”的研究论文。该研究利用广泛靶向代谢组以及转录组比较分析了不同嫁接方式对“纽荷尔”脐橙果皮中类黄酮生物合成的影响，为柑橘嫁接的应用价值和促进柑橘营养类黄酮成分的积累提供了新的视角。迈维代谢提供了广泛靶向代谢组以及代谢组检测服务。
研究背景
嫁接技术被广泛运用在柑橘栽培种植中，不同砧木嫁接对柑橘的生长发育、果实品质和产量产生重要影响。然而，研究者对不同砧木嫁接后柑橘果皮中黄酮类化合物的合成影响了解有限。
研究材料
选择中国凉山州雷波县金沙江旁一株13年树龄的“纽荷尔”脐橙树嫁接在枳（ct）和香橙（cj）上作为样本。每个接穗-砧木组合的柑橘样品在果实膨大期(开花后150天)、果实膨大后期(开花后180天)、果实转色期(开花后210天)和果实成熟期(开花后240天)4个阶段采集。每个组三个生物学重复。
研究思路
研究结果
ct和cj样本中的总类黄酮含量从150DAF的 (1692.42 μg/g, 1337.38 μg/g)增加到180DAF 的(2317.67 μg/g, 1791.67 μg/g)，在180DAF达到峰值。在210DAF时，ct和cj样本中的总类黄酮含量没有显著差异。在150DAF、180DAF和240DAF时，ct样本中的总类黄酮含量显著高于cj。因此作者选择150DAF (ct1, cj1)、180DAF (ct2, cj2)和240DAF (ct3, cj3)样品进行类黄酮代谢组分析，共检出703种类黄酮。其中ct2和cj2差异显著，这与总类黄酮含量变化趋势一致。703个类黄酮被分为8类，其中黄酮占总类黄酮的比例最高(380,54.1%)，其次是黄酮醇(157,22.3%)和黄酮类(64,9.1%)。热图分析显示，查尔酮、黄酮、黄烷醇、黄酮醇和其他类黄酮对ct1有显著贡献。查尔酮、二氢黄酮醇、黄烷酮和黄烷醇导致ct2中总类黄酮含量高于cj2，而ct3中仅黄酮和黄烷醇对总类黄酮含量有主要贡献。分析表明，黄酮类化合物可能是导致ct和cj果皮总类黄酮含量差异的最重要的类黄酮化合物。采用FC＞2或＜0.5来确定DAFlv，采用韦恩图说明DAFlv在六组中的分布。ct2 vs cj2存在123个DAFlvs，与ct1 vs cj1(19个)和ct3 vs cj3(94个)相比，DAFlvs数量最多。对这123个DAFlvs进行分析，其中黄酮(72)、黄酮醇(17)和黄烷酮(12)的含量最多。而8个类中DAFlvs的数量与总类黄酮含量没有相关性。ct2 vs cj2、ct3 vs cj3、ct2 vs cj2和ct3 vs cj3、ct1 vs cj1、ct1 vs cj1和ct3 vs cj3、ct1 vs cj1和ct2 vs cj2分别鉴定出92、61、24、7、5和3种类黄酮化合物。3个比较组中（ct1 vs cj1、ct2 vs cj2、ct3 vs cj3）均存在4种类黄酮化合物(3,4’-Dihydroxyflavone，Chrysoeriol-7-O-(6’’-feruloyl)glucoside，Cirsimaritin 5-[6’’-(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl)Glucoside]，和Tricin-7-O-(2’’-Sinapoyl)glucuronide)，表明它们受到不同砧木嫁接的影响。此外，在不同发育阶段之间进行两两比较。6个比较组中共有21种类黄酮化合物，包括15种黄酮类化合物、2种黄酮醇类化合物、2种其他类黄酮化合物、1种黄烷酮类化合物和1种异黄酮类化合物，说明它们受不同发育时期的影响显著。这25种类黄酮化合物用于后续分析。
ct和cj果皮类黄酮代谢组分析。(A)主成分分析；(B)组内组间相关性分析；(C) ct和cj果皮中703个类黄酮的分类和比例。(D) ct和cj果皮中8类黄酮类化合物在3个发育时期的热图
对18个样品进行RNA-seq分析。在三个发育阶段使用韦恩图来识别DEGs，使用| log2(fold change) | > 1和FDR < 0.05筛选比较组的DEGs。结果显示，ct1 vs ct3共有882个DEGs, cj1 vs cj3共有524个DEGs，表明这些DEGs是导致ct果皮中总类黄酮含量增加的原因。K-means聚类分析表明，所有DEGs被分为7类，第2类、第4类、第5类、第6类和第7类DEGs表达趋势与ct和cj果皮中总类黄酮含量一致，其可能含有影响ct和cj果皮之间类黄酮生物合成的基因。基于KEGG富集和GO功能分析，本研究鉴定出38个编码类黄酮生物合成酶的基因，这些基因包括2个CHS基因、1个CHI基因、3个FNS基因、9个IF基因、1个F3’H基因、8个F3’H基因、1个F3’5’H基因、7个FLS基因、1个LAR基因、1个ANR基因和4个ANR基因。作者比较了ct和cj之间25种黄酮类化合物的相对含量。ct1 vs cj1中，有6个类黄酮化合物增加，17个类黄酮化合物减少，而ct2 vs cj2中，分别有13和12个类黄酮化合物上调和下调，ct3 vs cj3中，有14种类黄酮化合物增加，9种类黄酮化合物减少。表明类黄酮化合物的含量在不同的比较中呈现出不同的趋势。
DEGs富集途径及表达模式分析。(A) ct和cj果皮中DEGs的韦恩图；(B) DEGs的K-means图；(C) ct和cj中DEGs的GO富集图；(D) ct和cj中DEGs的KEGG富集图
采用Pearson相关分析对生物合成途径中38个候选基因的表达水平与类黄酮含量进行分析。结果表明，1个CHS 基因 (CHSY)、1个CHI 基因(FAP3)、3个FNS 基因 (C93B2、2C9B16)和1个FLS 基因 (IDS3)与1种黄酮、1种黄酮醇和多数黄酮显著相关。两点图显示CHS基因(Cs_ont_3g009610)与FLS基因(Cs_ont_5g025740)表现出相同的趋势，CHI基因(Cs_ont_5g033840)与两个FNS基因(Cs_ont_5g024870, Cs_ont_5g024890)表现出相似的趋势。结果表明，6个基因对类黄酮化合物的生物合成具有重要调控作用，尤其是黄酮类化合物。为研究TFs调控ct和cj果皮中6个枢纽结构基因的差异积累，作者进一步分析了TF编码基因的转录本。共鉴定出1887个TFs，643个差异表达。其中，1个TF被注释到类黄酮生物合成途径上，447个未被KEGG、NR、Swissprot、sway、KOG、GO和Pfam数据库注释，表明这448个TFs可能调控DAFlvs。排名前10位的TF家族有249个差异表达TFs，包括AP2/ERF-ERF、NAC、MYB、C2H2、MYB-related、C2C2-Dof、LOB、B3、HB-HD-ZIP等。作者评估了6个枢纽结构基因在ct和cj果皮中与249个差异表达的TFs之间的类黄酮生物合成调控网络。在调控网络中，CHS基因与3个TFs正相关，包括1个AP2/ERF-ERF 转录因子(CsDREB3)。5个TFs (2个CsEF114、CsERF03、CsMYB06和CsMYB102)与FLS结构基因呈正相关，1个TF与FLS结构基因呈负相关。此外，11个TFs (CsEF105、2CsAS1、CsDREB3、CsEF119、CsMYB17、CsERF39、CsEF106、cserf24、CsERF35和CsERF23)与C9B16(FNS、Cs_ont_5g024870)呈正相关，5个TFs (CsMYB10、CsAS1、CsDREB3、CsEF106和CsRAP24)与C93B2 (FNS)呈正相关。2个TFs与C9B16 (FNS, Cs_ont_5g024890) 呈负相关，只有1个TF与C9B16呈正相关。以上结果表明，上述19个TFs可调控相关结构基因的表达，导致类黄酮化合物的差异性积累。最后，作者对上述6个结构基因和19个TFs进行了qRT-PCR，结果显示了转录组数据的可靠性和准确性。
ct和cj果皮类黄酮生物合成途径。(A)类黄酮生物合成通路热图；(B) ct和cj中25种类黄酮化合物在三个时期的含量分布
不同砧木嫁接“纽荷尔”脐橙果皮类黄酮化合物、结构基因和TFs参与类黄酮化合物生物合成的假设模型图
第3篇
转录组和UPLC-MS/MS揭示不同砧木嫁接后'纽荷尔'脐橙氨基酸生物合成机制
期刊：frontiers in plant science
发表时间：2023年7月
单位：四川农业大学
2023年7月，四川农业大学园艺学院在frontiers in plant science发表了题为“Transcriptome and UPLC-MS/MS reveal mechanisms of amino acid biosynthesis in sweet orange ‘Newhall’ after different rootstocks grafting”的研究论文。该研究基于转录组同时结合氨基酸含量变化研究了不同砧木嫁接后“纽荷尔”脐橙氨基酸生物合成机制，该研究结果进一步强调了砧木选择在提高柑橘类水果营养价值方面的重要性，并可能有助于功能性柑橘类食品和营养氨基酸补充剂的开发。迈维代谢提供了广泛靶向代谢组和转录组检测服务。
研究背景
嫁接在柑橘生产中很常见。不同砧木类型直接影响柑橘的果实品质和营养风味。然而，通过不同砧木嫁接对柑橘代谢产物的影响研究非常有限，特别是氨基酸（AA）。初步试验表明，两种砧木（枳（CT）和香橙（CJ））嫁接后的总氨基酸含量存在显著差异。CJ嫁接后，果皮总氨基酸含量高于果肉。然而，影响氨基酸差异积累的分子机制仍不清楚。
研究材料
13年树龄的“纽荷尔”脐橙树嫁接在枳（CT）和香橙（CJ）上作为样本。每个接穗-砧木组合的柑橘样品在果实膨大期(开花后150天)（CT1，CJ1）、果实膨大后期(开花后180天) （CT2，CJ2）、果实转色期(开花后210天) （CTT，CJJ）和果实成熟期(开花后240天) （CT3，CJ3）4个阶段采集。每个组三个生物学重复。
研究思路
研究结果
在成熟过程中，CT和CJ之间总氨基酸含量差异显著。幼果期和膨大期CJ总氨基酸含量显著高于CT，而果实成熟期CT总氨基酸含量高于CJ。选择三个发育阶段（90DAF、150DAF和240DAF）进行UPLC-MS/MS 分析。PCA，OPLS-DA分析显示样本和不同发育阶段之间的差异显著。总共鉴定出110种氨基酸及其衍生物，其中包括5种必需氨基酸，首次发现柑橘中含有大量氨基酸。HCA 将 110 个 AA 分为三组。簇I由31种AA组成，在果实膨大期的CT和CJ果皮中含量较低，包括 L-同型半胱氨酸。Cluster II 包含34个AA，包括L-色氨酸、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸和L-蛋氨酸。聚类III包括45个 AA，主要集中在果实幼期。总体趋势表明，CT和CJ果皮的氨基酸含量从幼果期到果实膨大期呈上升趋势，然后从果实膨大期到果实成熟期下降，这与总氨基酸含量一致。在这110种氨基酸中，5种是必需氨基酸，其中L-缬氨酸在90 DAF中含量最高，但L-苯丙氨酸在210 DAF和240 DAF中含量最高。柱形图分析显示，CT1 vs CT2、CT1 vs CT3 和 CT2 vs CT3 中分别存在 42，57，46个DAA。同样，在 CJ1 vs CJ2、CJ1 vs CJ3 以及 CJ2 vs CJ3 中分别鉴定出 46、49 和 44 个 DAA。作者发现 11 种 DAA 很常见，并且其含量在 6 个比较组中存在显著差异，表明生物合成这些AA的比例受到发育阶段的影响。六种氨基酸（S-甲基-L-半胱氨酸、L-正亮氨酸、L-赖氨酸、L-天冬酰胺、3,4-二羟基-L-苯丙氨酸和苯丙氨酸-缬氨酸）含量在8月份达到峰值，表明这些氨基酸对果实膨大期总氨基酸含量贡献较高。另外，3,4-二羟基-L-苯丙氨酸和苯丙氨酸-缬氨酸在6月份未检出，8月份含量达到高峰，直至果实成熟阶段含量下降。
不同发育阶段和不同砧木嫁接对20种AA的影响。(A)不同发育期对11种AAs含量变化的影响；(B)不同砧木嫁接对CT1 vs CJ1、CT2 vs CJ2、CT3 vs CJ3中10个AA的log2 FC值的影响
在 CT 和 CJ的三个时期内总共检测到 9,681 个 DEG，并且这些基因被分为三个亚类：亚类1(2,963DEG)、亚类2(3,729DEG)和亚类3(2,989DEG)。DEGs模式与亚类2中的总氨基酸含量一致。此外， KOG功能分类显示 564个基因参与氨基酸转运和代谢。为进一步研究这些 DEG 的变化，绘制维恩图和火山图。对这些DEG进行KEGG 和 GO 分析。KEGG气泡图显示，与氨基酸生物合成相关的多种途径在CT和CJ中显著富集。CT2 vs CT3 以及 CJ2 vs CJ3 相比，代谢途径、碳代谢、糖酵解或糖异生、光合作用、氨基酸生物合成和柠檬酸循环显著富集。作者绘制了氨基酸生物合成途径，筛选了17个与氨基酸合成相关的基因，并分析了CT和CJ果皮的氨基酸含量与结构基因的相关性。基因表达水平热图显示了 CT 和 CJ 果皮中结构基因的不同表达模式。CT 和 CJ 果皮中 L-同型半胱氨酸、L-组氨酸、L-鸟氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸和 L-缬氨酸含量均下降。相应地，D-3-磷酸甘油酸脱氢酶核糖-5-磷酸异构酶（RPI）、半胱氨酸合酶（CYSK）、天冬氨酸转氨酶（AAT）、丙酮酸激酶（PK）和天冬酰胺合成酶（ASNS）也减少了。随着CT1 vs CT2、CJ2 vs CJ3中RPI表达降低，L-组氨酸含量降低。类似地，当CJ1 vs CJ2中组氨醇脱氢酶( HIS )的表达水平降低时，L-组氨酸含量降低。L-缬氨酸含量随着丙酮酸激酶（ PK）和支链氨基酸转氨酶（BCAT）表达的增加而降低。相反，当分支酸变位酶（CM）的表达水平增加时，L-苯丙氨酸积累，而当预苯酸脱氢酶（TYRA）的表达水平增加时，L-酪氨酸减少等等。除少数例外，大多数氨基酸含量与结构基因的表达模式相对应。氨基酸生物合成途径清楚地揭示了氨基酸含量与结构基因之间的联系，这为进一步研究CT和CJ果皮的氨基酸生物合成奠定了基础。
CT和CJ果皮氨基酸合成途径。(A) CT和CJ不同成熟期主要氨基酸含量分布；(B) CT和CJ不同成熟期氨基酸合成相关基因的表达谱；(C)氨基酸生物合成途径中结构基因与代谢物合成关系图
作者通过柑橘皮氨基酸含量和结构基因的组间相关分析，研究了参与氨基酸生物合成的枢纽基因。结果显示，CT中L-赖氨酸、L-蛋氨酸和L-色氨酸与CM呈正相关，但L-苯丙氨酸与大多数基因表达呈正相关。相反，L-同型半胱氨酸、L-酪氨酸、L-组氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸和L-鸟氨酸与SERA、METE、ACO、ASSY、CYSK、HIS、AK的表达呈负相关。RPI基因表达水平与CJ中大部分AA相关，推测RPI在CJ的氨基酸生物合成中比在CT中发挥更关键作用。L-苯丙氨酸与CM表达显著相关。BCAT、SERA、METE、TYRA、ACO、PK、AK和PFK基因表达与L-胱氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸和L-鸟氨酸呈负相关。在本研究中，使用13种氨基酸含量和与氨基酸生物合成途径相关的19个结构基因的表达水平进行RDA分析。RDA结果显示，结构基因的表达水平在CT和CJ中的贡献率分别占96.76%和95.24%。此外，结果显示样品之间存在明显差异，表明不同砧木嫁接和发育阶段显著影响氨基酸生物合成。在CT中，CM的表达水平与L-天冬酰胺、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸和L-苯丙氨酸显著相关。然而，CJ中基因表达水平与前述AA含量之间没有显著相关性。总的来说，结果表明CM、RPI、BCAT、SERA、METE和ACO在“纽荷尔”脐橙果皮的氨基酸生物合成中发挥着重要作用，突出了它们在柑橘发育过程中氨基酸积累的重要性。
氨基酸生物合成途径中氨基酸与合成基因的相关分析（A, B）和冗余分析RDA分析（C, D）
本研究通过共表达网络结合代谢谱来识别 CT 和 CJ 果皮的枢纽基因。对不同模块和性状进行相关性分析，以寻找与氨基酸生物合成相关的基因簇。其中brown模块与大多数AA表现出较高的相关系数。值得注意的是，brown模块中的大多数基因在幼果期的表达水平高于果实膨大期，然后在果实膨大期与果实成熟期的表达水平降低。这一趋势与总氨基酸含量变化一致。因此，选择brown模块进一步筛选hub基因。在brown模块中，鉴定出9个结构基因，分别是CsPFKA2（Cs_ont_2g000110）、CsRPI4（Cs_ont_2g008890）、CsRER6（Cs_ont_7g002290 ）、CsBCAT2（Cs_ont_8g027050）、CsBCAT6（Cs_ont_8g027100）、CsAAT1 (Cs_ont_6g013390)、 CsAAT3 (Cs_ont_4g003990)、CsTSJT1 (Cs_ont_2g005360 ) ）和CsASNS1 (Cs_ont_8g000470)。使用brown模块中的九个结构基因和转录因子（TF）构建共表达网络。在共表达网络中鉴定出41个与至少7个结构基因高度相关的TF，其中包括 5 个NAC、4 个AP2/ERF-ERF、3 个MYB、2 个bHLH、2 个bZIP、2 个HB-HD-ZIP、2 个FAR1、2个HSF、2 个SBP、1 个WRKY、1 个PLATZ、1 个C2C2 ->C2C2-Dof1，一个C2C2，一个C3H。其中，12个TF与8个结构基因相关。因此，9个结构基因和12个转录因子可能在CT和CJ果皮的氨基酸生物合成中发挥重要作用。此外，通过qRT-PCR分析了这21个基因的表达模式。除少数例外，这些基因的相对表达水平与RNA-seq中的FPKM值基本一致，表明转录组数据整体的可靠性。
brown模块中结构基因与tf的共表达网络
砧木嫁接对AAs差异生物合成影响的模型图
第4篇
广泛靶向代谢组学与转录组分析相结合揭示了镁胁迫对'纽荷尔'脐橙中类黄酮的生物合成的影响
期刊：frontiers in plant science
发表时间：2023年5月
单位：四川农业大学
2023年5月，四川农业大学园艺学院在frontiers in plant science发表了题为“Widely targeted metabolomics profiling combined with transcriptome analysis sheds light on flavonoid biosynthesis in sweet orange 'Newhall' (C.sinensis) under magnesium stress”的研究论文。该研究综合广泛靶向代谢组学与转录组分析揭示了镁胁迫对“纽荷尔”脐橙中类黄酮的生物合成的影响。迈维代谢提供了广泛靶向代谢组以及转录组检测服务。
研究背景
“纽荷尔”脐橙皮 (SOP) 富含类黄酮，使其在营养、食品和医药领域越来越受欢迎。然而，对于SOP中的黄酮类成分以及镁胁迫下黄酮类生物合成的分子机制仍知之甚少。
研究材料
选择中国凉山州雷波县13年树龄的“纽荷尔”脐橙 6月的幼果期(开花后90天，90DAF)、8月的快速膨大期(开花后150天，150DAF)和11月的果实成熟期(开花后240天，240DAF)样品。MS样品采自无缺镁症状的枝条，MD样品采自缺镁导致叶片发黄的枝条。每组三个生物学重复。
研究思路
研究结果
在三个阶段收集MS和MD的果实和叶子进行分析。MD叶的叶肉变黄，叶脉保持绿色，呈倒V形。相比之下，MS 叶子在整个采样期间保持绿色。MD叶片出现缺镁现象，分析表明MD叶片的镁含量为264.16 mg/kg，低于最佳镁含量。相比之下，MS叶片中的镁含量为914.28 mg/kg，高于适当的镁含量范围。接着作者分析了总黄酮含量、MDA 含量和SOD活性。结果表明，MS中总黄酮含量在幼果期由1303.16 μg/g上升至膨大期的1670.58 μg/g，在果实成熟期下降至1220.46 μg/g。在MD中，类黄酮含量从2000.38μg/g增加到2285.73μg/g，然后减少到1826.01μg/g。MD 中的总黄酮含量始终高于MS中的总黄酮含量。MS和MD的MDA含量和SOD活性与总黄酮含量趋势一致。从MS和MD果皮样品中总共检测到 1,533 种代谢物，其中黄酮740 种（48.27%）。PCA、OPLS-DA、相关分析和HCA的结果反映了类黄酮谱差异与发育阶段和镁胁迫有关。
镁胁迫下 MS 和 MD 果皮中类黄酮代谢物的分析。(A)混合样品质谱分析总离子色谱图；(B)基于类黄酮丰度的18个样品的PCA图；(C)样本相关性分析；(D)类黄酮代谢物热图
根据C3-C6-C3结构的修饰，将740种黄酮类化合物分为8类：黄酮类402种、黄酮醇类80种、黄烷酮类65种、查尔酮类31种、异黄酮类30种、黄烷醇类9种、黄酮醇类9种、其他黄酮类14种。Kmeans 分析显示所有黄酮类化合物可分为六类。六个簇中的两个（第2类和第3类）的变化趋势与总黄酮含量一致。此外，不同发育阶段的MS和MD之间的黄酮类化合物存在显著差异。簇2和簇3的黄酮比例最高（98），表明这些簇可能在SOP中镁胁迫下的类黄酮生物合成中发挥关键作用，黄酮受到显著影响。根据FC≥ 2 or ≤ 0.5 和VIP ≥1进行差异代谢物筛选。其中，在MS1与MD1中鉴定出57个DAF，其次是MS2 vs MD2 (25) 和 MS3 vs MD3 (97)。MD中的DAF数量多于MS，表明黄酮类化合物可能更容易受到镁胁迫的影响。KEGG通路富集分析表明，类黄酮生物合成、苯丙素生物合成、黄酮及黄酮醇生物合成、次生代谢物生物合成和代谢途径是主要富集途径。
镁胁迫下MS和MD果皮中类黄酮代谢物的差异分析。(A) SOP 中检测到的 740 种黄酮类化合物的分类和比例；(B) SOP 中差异代谢的趋势分析；(C) DAF 的维恩图；(D) MS2 vs MD2、MS1 vs MS3、MD1 vs MD3中DEG的KEGG 富集分析
转录组结果显示，三个阶段共检测到17,897个差异表达基因（DEG）。热图聚类分析显示不同处理之间基因表达存在显著差异。GO，KEGG注释分析了DEGs功能。其中KEGG主要富集包括代谢途径（ko01100）、次生代谢物生物合成（ko01110）、MAPK信号通路-植物（ko04016）、植物激素信号转导（ko04075）、苯丙素生物合成（ko00940）和镁胁迫下的类黄酮生物合成（ko00941）等途径。为了构建共表达网络，WGCNA分析在MS和MD中识别出九个模块。在三个发育阶段，MS 和 MD 模块之间的基因表达模式有所不同。利用21个DAF作为性状，与模块进行相关性分析。yellow模块被发现与15种黄酮类化合物相关，并且与7种黄酮类化合物的相关性最高。bule模块与柚皮素、短叶松黄烷酮（、异杞柳苷、柚皮素查尔酮的含量呈正相关。yellow模块中大多数基因的表达水平在镁胁迫下增加，且MD的表达水平高于MS。这与总黄酮含量的变化趋势一致。对yellow模块的GO分析表明，其DEG在生物过程类别中的代谢过程和细胞过程以及分子功能类别中的结合和催化活性显著富集。KEGG富集分析显示，yellow模块基因中的苯丙素生物合成、异黄酮生物合成、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成等方面富集了40多个DEG。
MS 和 MD 中DEG 和 DAM 的综合分析。(A)软阈值的确定；(B)进行共表达模块计算的基因网络热图；(C)模块热图；(D)模块-性状关系热图
基于与yellow模块中黄酮含量的强正相关性构建基因共表达网络。网络图识别出3个结构基因（1个CitLAR (Cs_ont_7g019870)、1个CitU88B1 (Cs_ont_9g026820)、1个参与类黄酮生物合成途径的 CitSNL6 (Cs_ont_2g029030)）。在相互作用网络图中，10个转录因子与6种黄酮类化合物具有很强的相关性。这些TF基因中，有2个C2C2-Dofs、2个NACs、1个PLATZ、1个MYB、1个C2H2、1个FAR1、 1 个RWP-RK和 1 个DBP。同样，blue模块包含参与类黄酮合成的三个结构基因（2 CitF3 ' H (Cs_ont_2g033020、Cs_ont_9g024120)、1 CitCHS (Cs_ont_3g009610)）。该网络确定了6个结构基因和10个TF基因作为SOP中类黄酮积累的关键调节因子。为验证类黄酮相关基因的表达模式，对WGCNA共表达网络中的6个中心结构基因和10个中心TF基因进行了qRT-PCR。结果证实了转录组数据的准确性和可重复性。
黄酮合成结构基因，IF与黄酮代谢物的相关性网络图
为了研究不同发育阶段SOP中类黄酮生物合成的变化，对转录组和代谢组学数据进行了综合分析。根据模式植物报道的黄酮类生物合成途径，构建了SOP中结构基因和黄酮类化合物表达的通路图。共有41个结构基因和21个黄酮类化合物被定位到黄酮类生物合成途径。
镁胁迫下 MS 和 MD中的类黄酮生物合成通路热图
相关性分析显示，表没食子儿茶素和橙皮素7-O-葡萄糖苷与CitCHI（Cs_ont_7g003040）和1种CitCHS（Cs_ont_9g012610）显著正相关。CCA分析筛选SOP中黄酮类化合物生物合成的关键基因。结果表明，Cit PAL、Cit C4H、Cit 4CL、Cit FNS、Cit FLS、Cit F3'H 和Cit等 10 个基因在 SOPs 类黄酮生物合成中发挥重要作用。基因根据其空间分布分为两组。第一组包括Cit PAL (Cs_ont_7g006400)、Cit 4CL (Cs_ont_2g023650、Cs_ont_5g016610)、Cit FNS (Cs_ont_5g024870)、Cit ANS (Cs_ont_6g014730) 和Cit F3'H (Cs_ont_9g02) 4140)，第二组包括Cit C4H (Cs_ont_4g024900、Cs_ont_1g016250 )、Cit CHS (Cs_ont_9g012610) 和Cit FLS (Cs_ont_1g002760)。这些结果也表明了镁胁迫对果实生长发育不同阶段的黄酮类化合物存在影响。
SOP中类黄酮生物合成主要贡献基因的筛选。(A) 21 个类黄酮和 41 个类黄酮合成相关基因的组间相关性分析；(B) SOP 中 MS 和 MD 之间 21 种类黄酮和相关合成基因的典型相关性(CCA)分析
镁胁迫下 SOP 中类黄酮生物合成的模型图
该项目由四川农业大学园艺学院青年教师熊博、硕士研究生李琴为论文共同第一作者，四川农业大学园艺学院汪志辉教授、熊博博士为论文通讯作者。该研究受到国家重点研发计划项目、农业农村部重点实验室开放课题及四川省科技计划项目的资助。
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