挑战遗传缺陷，CRISPR/Cas9引领的革命性突破
1、CRISPR/Cas9介导的基因修复的基本原理
CRISPR/Cas9介导的基因修复的基本操作和做基因敲除（Knock out）基本一致，除此之外，它引入了一条修复模板（repair template），通常为单链寡核苷酸序列（ssODNs）[1]。sgRNA通过碱基互补配对将Cas9核酸酶引导到特定的基因组序列，Cas9核酸酶在PAM位点上游三个碱基处引入DNA双链断裂，这时真核细胞会通过两种不同的机制进行DNA修复。一种是非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ），另一种是同源重组（homology-directed repair, HDR）。非同源末端连接通过在DNA双链断裂处增加或删除几个碱基，在DNA连接酶的作用下，实现DNA修复，但这种机制通常会产生几个碱基的随机插入或缺失（indels），可能造成移码突变，进而导致基因失活。同源重组即真核细胞可以利用外源的DNA片段，精准复制外源的DNA片段中蕴含的遗传信息，以实现敲入（knock in）、点突变、插入缺失突变等，也可以用来实现基因修复，如图1所示[2]。CRISPR/Cas9介导的基因修复正是利用了同源重组的机制。
图1 CRISPR/Cas9基因编辑技术
2、在设计CRISPR/Cas9实验流程需注意的事项
需要注意的是，同源重组（HDR）发生的概率通常较非同源末端连接（NHEJ）要低[3]。此外，PAM 位点的选择、供体 DNA 的类型、供体 DNA 的浓度等因素也会对同源重组的效率产生影响[4]。
A、一般情况下，为了提高同源重组的效率，Cas9核酸酶的切割位点应尽可能靠近突变引入的位置。但是，并非所有插入位点附近都有合适的PAM位点，此时只能选择切割效率最高的PAM位点，同时距离插入位点越近越好，以尽可能地提高同源重组的效率。
B、在进行基因修复时，可以将插入位点放置在单链寡核苷酸（ssODNs）供体模板的中间位置。在具有较短同源臂的情况下，单链寡核苷酸（ssODNs）由于其自身的特点，能够产生比双链DNA（dsDNA）更高的同源重组效率。ssODNs模板中同源臂长度通常在50~100个碱基，这被普遍认为足以有效促进同源重组的发生。实际上，增加任意一端的同源臂长度可能会对ssODNs的合成和递送过程带来一定的困难。
C、在CRISPR/Cas9介导的基因修复中，如果在donor模板中保留了原来的PAM序列，则存在再次被CRISPR/Cas9识别和切割的风险。为了避免这种情况发生，通常会引入同义突变而改变PAM位点的序列，使其无法被CRISPR/Cas9再次识别。
3、应用实例
通过CRISPR/Cas9对患者衍生的iPSC系进行了基因修复，以治疗囊性纤维化、血友病A和β-地中海贫血等遗传疾病[5-7]。最近的研究，已经能够在小鼠模型中实现了基因矫正，比如治疗遗传性耳聋（通过脂质复合物递送）、血友病B（通过AAV递送）和α1-抗胰蛋白酶缺乏症（通过AAV递送）等疾病[8-10]。
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参考文献 ：
1、Zhao, Pei et al. “Oligonucleotide-based targeted gene editing in C. elegans via the CRISPR/Cas9 system.” Cell research vol. 24,2 (2014): 247-50. doi:10.1038/cr.2014.9
2、Chen, Minjiang et al. “CRISPR-Cas9 for cancer therapy: Opportunities and challenges.” Cancer letters vol. 447 (2019): 48-55. doi:10.1016/j.canlet.2019.01.017
3、Paix, Alexandre et al. “Scalable and versatile genome editing using linear DNAs with microhomology to Cas9 Sites in Caenorhabditis elegans.” Genetics vol. 198,4 (2014): 1347-56. doi:10.1534/genetics.114.170423
4、Banan, Mehdi. “Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells.” Journal of biotechnology vol. 308 (2020): 1-9. doi:10.1016/j.jbiotec.2019.11.010
5、Firth, Amy L et al. “Functional Gene Correction for Cystic Fibrosis in Lung Epithelial Cells Generated from Patient iPSCs.” Cell reports vol. 12,9 (2015): 1385-90. doi:10.1016/j.celrep.2015.07.062
6、Liu, Yali et al. “One-Step Biallelic and Scarless Correction of a β-Thalassemia Mutation in Patient-Specific iPSCs without Drug Selection.” Molecular therapy. Nucleic acids vol. 6 (2017): 57-67. doi:10.1016/j.omtn.2016.11.010
7、Park, Chul-Yong et al. “Functional Correction of Large Factor VIII Gene Chromosomal Inversions in Hemophilia A Patient-Derived iPSCs Using CRISPR-Cas9.” Cell stem cell vol. 17,2 (2015): 213-20. doi:10.1016/j.stem.2015.07.001
8、Gao, Xue et al. “Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents.” Nature vol. 553,7687 (2018): 217-221. doi:10.1038/nature25164
9、Ohmori, Tsukasa et al. “CRISPR/Cas9-mediated genome editing via postnatal administration of AAV vector cures haemophilia B mice.” Scientific reports vol. 7,1 4159. 23 Jun. 2017, doi:10.1038/s41598-017-04625-5
10、Stephens, Calvin J et al. “Targeted in vivo knock-in of human alpha-1-antitrypsin cDNA using adenoviral delivery of CRISPR/Cas9.” Gene therapy vol. 25,2 (2018): 139-156. doi:10.1038/s41434-018-0003-1
