2023.7.18华中农业大学全英文选修课程生物技术中的微生物学课程第七节课程要点

今天是第七天，我们将从植物生长促进的细菌开始谈起，这些细菌我们称之为PGPRS。微生物群落的定义是所有微生物的集合，而微生物指的是微生物组成的生活环境。植物微生物群落包括与植物相关的所有细菌和微生物。生物之间从未独处，它们总是与其他生物一起生活在地球上，这就是微生物群落。在农业和环境领域，有一个特殊的微生物群落，我们称之为根际微生物群落，是指植物根际的细菌。PGPRS是一类能促进植物生长的根际细菌，可以提高农作物产量、增强根系和茎的生长，被广泛应用于马铃薯、甜菜、萝卜等作物以及草坪草。

PGPRS最早由Dr. Clapper在1980年发现，他发现了根瘤菌属细菌，这些细菌会分泌出一种叫做铁载体的化学物质，可以将土壤中的铁离子结合起来，从而防止植物病原菌感染植物。PGPRS分为三个类别：生物保护剂、生物肥料和生物刺激剂。生物保护剂可以抑制植物病害、增强植物免疫系统，生物肥料可以增强土壤养分、固定氮素，提高植物的生长和产量。氮素在生物体内主要用于合成蛋白质，因此氮固定对于植物的生长十分重要。

PGPRs能够通过三种方式帮助作物生长，分别是肥料作用、生长刺激作用和激素合成作用。常见的PGPRs包括芽孢杆菌、假单胞菌等。这些菌可以通过筛选和培养来开发成对特定作物有益的PGPRs。在开发过程中，首先需要收集植物生长最好的土壤，然后进行筛选和培养，最终形成产品。由于PGPRs大多数是革兰氏阳性菌，因此可以形成芽孢，具有较长的货架寿命，方便存储和销售。此外，PGPRs还可以通过固氮和转化磷等作用，为作物提供生长所需的氮和磷元素。其中包括从土壤中分离PGPR的方法和问题、PGPR在不同环境中的适应性问题、PGPR的性质和对作物的影响，以及如何基因工程PGPR以实现双重功能。其中，存在着大量未被研究的菌株，多数PGPR的生长受到环境因素的制约，PGPR的应用可能会受到限制，如存在人体致病菌。对于双重功能的PGPR，需要找到适合的菌株来促进草坪生长，并能杀死草坪害虫。其中，通过工程菌株来杀死害虫需要寻找并利用能杀虫的蛋白质，例如诱导虫体凋亡的蛋白质。

关于如何利用不同的基因工程技术来制造能杀死昆虫的细菌。提到的技术包括plasmid、homologous recombination、transposon以及CRISPR-Cas9等。首先，要选择一个合适的载体，并在载体上插入cry protein基因和适当的启动子，以激活cry protein的表达。但是，由于细菌不会一直保留plasmid，因此使用plasmid不是最好的选择。相反，可以使用homologous recombination或transposon等技术，将cry protein基因插入到细菌染色体上，并使其稳定地保留在染色体上。另外，对话中还简要介绍了如何使用CRISPR-Cas9技术向细菌中插入cry protein基因，需要设计合适的引导RNA、修复模板等，最后将这些基因和模板导入到细菌中。

基因组编辑可以通过使用转座子或CRISPR系统来实现。转座子可以随机插入基因，而CRISPR系统则具有更精准的定位特性。选择哪种方法取决于实验目的和研究者的经验。重组蛋白表达的目标是将某个生物体中的DNA移植到另一个生物体中，使得后者能够表达目标蛋白。这个技术可以用于生产酶、药物和研究蛋白质相互作用等方面。E. coli是一种常用的表达宿主，因为它生长速度快且成本低。不同的表达菌株具有不同的基因型和表达特性，需要根据实验需要进行选择。讨论了大肠杆菌（E. coli）在生产蛋白质时可能出现的问题以及解决方法。以下是主要学习要点的中文总结：大肠杆菌可能含有蛋白酶（protease），它会将蛋白质剪切成碎片，导致无法生产所需的蛋白质。为了避免这种情况发生，可以通过删除编码蛋白酶的基因，如P，来避免蛋白质被剪切。Arabinos Operan是一种能够降解糖分子arabinose的酶，如果大肠杆菌含有该酶，会导致表达的基因被关闭。因此，可以使用BL21AI，它的染色体中删除了Arabinos Operan，从而可以通过添加arabinose来激活所需的基因。Rosetta菌株是从BL21细胞中分离出的，它通过额外的质粒P rare来过度表达一些罕见的tRNA，从而提高了表达罕见密码子的基因的效率。异源基因的密码子使用可能与大肠杆菌不同，因此可以使用密码子优化的方法来改变密码子序列，以适应大肠杆菌的表达系统。还有其他类型的表达系统，如真核生物系统，例如Picchia Pastorus，可以用于生产蛋白质。为什么需要使用真核表达系统：真核系统可以进行后转录修饰，如糖基化等，而大肠杆菌系统则不具备这个功能。最常见的诱导质粒系统：包括乳糖诱导系统和阿拉伯糖诱导系统。阿拉伯糖诱导系统更紧密，不会发生泄漏，可以通过浓度调节进行逐渐增加的诱导。细菌在表达蛋白时的生长曲线：细菌的生长呈指数增长，在中指数期是最适合表达蛋白的时期。过早或过晚的表达都会影响蛋白的表达量。如何测量细胞数：在细菌表达蛋白时，需要用到细胞计数方法，常用的方法包括光密度测量和血细胞计数法等。

蛋白表达通常需要对序列进行编码优化，可以使用计算机算法进行优化，或者从公司购买经过编码优化的序列。不同的培养基可以影响蛋白的产量，常用的培养基有LB和TB。在进行蛋白表达时，需要对培养基进行孵育，并使用称为“Earlyn Meyer flask”的容器，放置在摇床上进行氧气供应。蛋白表达后，需要进行细胞破裂（lysis），以释放蛋白。可以使用酶解法、超声波法、法国压等方法进行破裂。在进行蛋白纯化时，可以使用亲和层析技术，如镍柱、钴柱和谷胱甘肽柱（glutathion beads）进行分离和纯化。光密度法（spectral photometer）可以用于测量培养基中细胞数量的光学密度（OD），以确定添加 IPTG 等诱导剂的时间点。培养温度通常为37°C，表达时间通常为4小时或过夜。建议对蛋白表达和纯化过程进行优化和标准化，以确保获得高质量的蛋白。

蛋白质表达的纯化和定量方法，以及T7系统的原理。纯化方法包括使用标签结构和柱层析，其中His6标签结构可以结合镍和钴，GST标签结构可以结合谷胱甘肽。定量方法包括Nano Drop、Bradford Assay和Densitometry。T7系统是一种利用T7噬菌体聚合酶和其自身启动子的表达系统，可以避免Lac操作子泄漏的问题。该系统包括染色体和质粒两部分，质粒上有Lac操作子启动子和T7启动子，染色体上有Lac抑制子和T7聚合酶基因。添加IPTG后，Lac抑制子会脱落，T7聚合酶开始表达，从而实现目标蛋白的表达。讲述了重组蛋白表达的内容。首先介绍了T7系统，该系统可以通过T7聚合酶和T7启动子来实现基因X的转录。其次，介绍了为什么需要使用T7系统，因为Lac操作子有些泄漏，而T7系统较为紧密。然后，介绍了Pbad质粒和Ek切割酶识别位点，这些都是用于重组蛋白表达的。为了检测重组蛋白是否表达，可以进行SDS-PAGE实验，通过比较带有和不带有诱导剂的样本来得出结论。一些常见的问题包括蛋白表达不足或不稳定，这些问题可能需要进行优化或添加标签。

讨论了一些关于重组蛋白表达过程中常见的问题以及解决方法。主要的问题包括污染物、蛋白质在表达过程中被降解、蛋白质表达的可溶性不足等。解决方法包括添加可溶性标签、增加洗涤步骤、更换柱子、使用特殊的细胞株等等。此外，还介绍了两步纯化和大小排除色谱等常见的两种纯化方法。