文献学习-视网膜微循环与糖尿病视网膜病变

摘要

微循环在向能量密集的视网膜神经元输送氧气和清除代谢废物方面起着关键作用。

微血管改变是糖尿病视网膜病变(DR)的一个标志性特征，是全球不可逆性视力丧失的主要原因。

以前的研究告诉了我们 DR 的临床分期和与毁灭性视力丧失相关的视网膜表现。

自从这些报道以来，组织学技术的重大进步加上三维图像处理促进了对健康和患病视网膜循环的结构特征的更深入的理解。此外，高分辨率视网膜成像的突破促进了组织学知识的临床转化，以更精确地检测和监测微循环障碍的进展。孤立灌注技术已应用于人类捐赠者的眼睛，以进一步加深我们对正常人类视网膜循环的细胞结构特征的理解，并为 DR 的病理生理学提供新的见解。组织学已被用于验证新兴的体内视网膜成像技术，如光学相干断层扫描血管造影（OCTA）。

我们首先提出一个标准化的组织学词典来描述人类视网膜微循环，然后讨论 DR 主要表现的病理生理机制，重点是微动脉瘤和视网膜缺血。目前的视网膜成像模式的优点和局限性，确定使用组织学验证也提出。最后，我们概述了我们的研究意义，并提供了一个未来的方向在 DR 研究的前景。

引言

视网膜微循环是内视网膜神经元营养供应的主要来源。脉络膜在氧化外部视网膜结构如光感受器中起着重要作用(Yu 和 Cringle，2001; Yu 等人，2007)。

每克体重，视网膜内测量的耗氧量使其成为人体内代谢最活跃的组织之一(Ames，1992)。因此，即使对视网膜循环相对较小的干扰也可能通过限制视网膜神经元的能量供应而导致毁灭性的视力丧失。

与人体内大多数其他血管系统不同，视网膜微循环是高度专业化的，并且表现出与每个视网膜层的独特能量需求相关的形态学改变(Country，2017; Yu et al。 ，2019a)。视网膜毛细血管床连接模式不一致的原因之一是组织学和体内成像技术的广泛差异，已被用来模拟视网膜毛细血管循环的结构。

糖尿病(DM)是一种流行病，预计在未来30年内会增加流行率。据估计，到2050年，仅在美国就有三分之一的成年人患有糖尿病(Boyle et al。 ，2001)。许多糖尿病患者最终会因为糖尿病视网膜病变(DR)而遭受某种形式的视力丧失。

微循环障碍是 DR 的一个关键特征，随着时间的推移可以逐步发展。研究人员提供了 DR 的各种表现，如棉絮斑、视网膜出血和视网膜新血管形成(Ashton，1949; Cogan 等，1961a)。

在过去的二十年中，组织学和临床成像技术在视网膜可视化方面取得了迅速的进展。例如，免疫组织化学与高分辨率共聚焦扫描激光显微镜的结合使得对健康和疾病中的视网膜微循环的精确研究成为可能(Yu et al。 ，2010b)。我们已经利用这些发展与孤立灌注技术的人类供体的眼睛，以提供新的定量信息之间的空间关系毛细血管床在视网膜。这些技术已经被用来扩大我们对病理生理机制的理解，这些机制是 DR 的基础。我们的研究小组也进行了广泛使用的成像工具的组织学验证，例如使用人类供体眼睛的荧光血管造影(FA)和光学相干断层扫描血管造影(OCTA)。

视网膜血管结构

视网膜内皮

视网膜内皮细胞形成视网膜脉管系统的最内层。

与脉络膜内皮细胞相比，视网膜内皮细胞是非开窗的，通过紧密连接相互连接，或者阻塞带形成血视网膜屏障(BRB)的一部分(Cunha-Vaz 等，2011)。

视网膜灌注的自动调节至关重要地依赖于血管活性物质(包括内皮素 -1和一氧化氮)的内皮释放以响应全身血压波动，缺氧和乳酸水平调节血管张力(Riva 等，1986; Yu 等，2004,2016)。

视网膜内皮细胞在形态学上是不均匀的(An 等，2020b; Yu 等，2010a)。动脉内皮细胞是长的纺锤形细胞，其长轴方向与血流方向平行。位于细胞体中央的内皮细胞的细胞核也被拉长，并具有相同的取向(图1A)。与低阶动脉和小动脉相比，高阶视网膜动脉内皮细胞具有更长和相对狭窄的细胞体(图1B)。毛细血管内皮细胞通常自行形成360 ° 的管状结构，细长的椭圆形细胞核在管腔内形成向内凸出的局部区域(图1C)。小静脉的内皮细胞类似于毛细血管，但有两个或更多的内皮细胞形成血管管(图1D)。较大的小静脉和静脉有多边形的内皮细胞和圆形的细胞核(图1E)。

周细胞

先前称为壁细胞的视网膜周细胞在低阶视网膜血管，即毛细血管，小静脉和末端小动脉的腔内方面被发现(Buzney 等，1983; Caporarello 等，2019; de Oliveira，1966)。在高阶血管中，血管平滑肌细胞(vsMC)存在，尽管这两种相关细胞类型之间的确切过渡点往往难以区分(图3a)。

在健康的视网膜中，周细胞和内皮细胞的比例是1:1(Huang，2020; Yanoff，1966)。此外，弗兰克和他的同事发现，周细胞过程覆盖超过85% 的毛细血管周长(弗兰克等，1990年)。周细胞功能包括通过血管生成素 -1/Tie-2增强 BRB，血小板衍生的生长因子途径和通过细胞因子释放调节免疫应答(Caporarello 等，2019; Huang，2020)。以前的研究也将收缩特性归因于视网膜周细胞，这被认为在视网膜灌注自动调节中起关键作用(Alarcon-Martinez 等，2019; Das 等，1988; Hamilton 等，2010)。

视网膜中周细胞的功能与大脑中的周细胞有一些相似之处，它们是血流的关键调节因子之一(Gonzales 等，2020; Sengillo 等，2013)。值得注意的是，与脉络膜不同，视网膜脉管系统没有自主神经支配，区域血流主要由自动调节控制(Alarcon-Martinez 等，2019; An 等，2020b; Kureli 等，2020)。使用免疫组织学标记很难从 VSMC 中分离出周细胞(Huang，2020)。在我们最近的研究中，我们发现 Hoechst (细胞核) ，αSMA 和 F- 肌动蛋白标记的组合允许周细胞结构的准确可视化(An 等，2020b，2022a)。

视网膜血管平滑肌细胞

视网膜血管平滑肌细胞与周细胞属于同一胚胎学谱系，存在于较大的视网膜小动脉、微静脉、动脉和静脉内。

血管平滑肌细胞收缩可以调节整个视网膜微血管系统的血流量。动脉血管平滑肌细胞也控制视网膜动脉的直径和弹性，以承受波动的全身血压和维持灌注。这反映了视网膜脉管系统的自动调节特性(Delaey 等，2000; Kornfield 和 Newman，2014; Yu 等，2019a; Yu 等，2010a)。

动脉 VSMC 在血管周围形成密集的相互连接的肌纤维，排列成环状模式，肌纤维的方向垂直于流动方向和内皮细胞的方向(图4)。我们观察到60μm 以上的大动脉，如视网膜分支动脉，可能含有两层 VSMC，而较小的动脉含有一层 VSMC。血管平滑肌细胞的细胞核通常被拉长，长轴与细胞的方向相同。(图2)。然而，一些不规则形状的细胞核也在健康的视网膜中被观察到(图4B)。肌肉纤维也可能具有不规则的分支模式，并相互连接起来发挥合胞体的功能。与动脉血管平滑肌细胞相比，静脉血管平滑肌细胞稀疏且组织较差(图1)。

星形胶质细胞

星形胶质细胞是位于视网膜表面的神经胶质细胞，主要位于神经节层(gCL)和神经纤维层(NFL)(Reichenbach and Bringmann，2020)。它们被认为是在胚胎发生和视网膜发育过程中通过视神经迁移到视网膜的(Provis，2001; Watanabe and Riff，1988)。在 GCL 中，星形胶质细胞通常具有星状形态，具有伴随和环绕浅血管丛(SVP)的血管的长过程，同时支持视网膜神经节细胞(RGC)的附近轴突，形成神经血管单位(图5A)(Yu 等，2010b)。

星形胶质细胞的一个关键功能是维持神经节细胞的稳态，并与周细胞和内皮细胞一起形成 BRB 的一部分。

Muller细胞

Muller 细胞，或称 Muller 神经胶质细胞，是脊椎动物视网膜神经胶质细胞的主要类型。在结构上，Muller 细胞不同于星形胶质细胞，因为它们是跨越整个神经视网膜厚度的大细胞，从玻璃体视网膜界面到光感受器层，其细胞体和细胞核位于内核层(INL)(Bringmann 等，2006; Kolb，1995)。Muller 细胞端足在玻璃体视网膜连接处形成内界膜。穆勒细胞与光感受器内部的粘附连接形成膜状外观，被称为外界膜(OLM)。这两个特征都有助于视网膜的结构完整性。鉴于 Muller 细胞的经视网膜特性，它们可以通过调节钙的摄取和释放来检测和响应视网膜机械张力(Lindqvist et al。 ，2010)。

Muller 细胞还执行大量非结构相关的功能，其中之一是通过介导离子，水和碳酸氢盐运输来维持视网膜细胞外环境的稳态(Reichenbach 和 Bringmann，2013)。此外，Muller 细胞通过进行糖酵解参与光感受器的代谢循环，其产物乳酸被用作光感受器内的主要能量来源，使用 Kreb 循环。Muller 细胞也通过调节谷氨酸神经递质的再摄取来参与神经元突触活动的调节。一个新认识的生理功能的穆勒细胞是他们的作用，光传输通过视网膜。由于它们的经视网膜细胞结构，它们充当光纤电缆，使光能够以最小的散射到达光感受器(Reichenbach 和 Bringmann，2013)。

小胶质细胞与循环炎性细胞

小胶质细胞是中枢神经系统和视网膜的常驻巨噬细胞。静止的小胶质细胞以分支形式存在于内部和外部丛状层(IPL; OPL)中，并在维持视网膜神经元稳态和细胞碎片的吞噬作用中起关键作用，同时在其促炎和抗炎状态之间保持平衡(Karlstetter 等，2015; Takahashi 等，2005)。在诸如 DR 等慢性疾病状态下，高血糖和氧化应激增加导致小胶质细胞活化并重置有利于促炎症状态的平衡(Gonzalez-Scarano 和 Baltuch，1999; Kinuthia 等，2020)。当这种情况发生时，小胶质细胞从分枝形式转变为变形虫形式，并且可以从丛状层迁移到视网膜的其他部分(Vujosevic 等，2013)。促炎细胞因子释放，包括白细胞介素 -1，白细胞介素 -6和肿瘤坏死因子-α α，导致视网膜组织炎症和血管细胞功能障碍，并可能最终导致血管渗漏或闭塞。

除了小胶质细胞，循环白细胞也参与视网膜炎症，血管功能障碍和闭塞。Noda 等报道了在糖尿病大鼠模型中观察到白细胞与动脉和静脉壁粘附的视网膜血管内的白血病抑制(Noda 等，2014)。在我们的实验室中使用灌注标记方法进行的人供体眼研究发现，毛细血管内白细胞抑制可能在 DR 中毛细血管非灌注机制中起关键作用，并且微动脉瘤内的白细胞抑制提示微动脉瘤病理生理学的炎症成分(An 等，2022b)。

视网膜孤立灌注

视网膜深部的精确标记和清晰可视化对于视网膜疾病领域的组织学家来说仍然是一个巨大的挑战，特别是当涉及到视网膜血管疾病的研究时。

研究视网膜脉管系统的常用方法包括胰蛋白酶消化，视网膜薄切片染色，全视网膜浸润染色，血管内注射染料和电子显微镜(Ashton，1953; Cogan 等，1968)。每种方法都有其独特的优缺点。

胰蛋白酶消化是一种技术上具有挑战性的方法，涉及在 Tris 缓冲液中用胰蛋白酶溶液消化非血管组织并仔细分离更耐药的血管组织(Ashton，1963; Zhou 等，2013)。它可以清晰地显示血管系统树及其内皮细胞。然而，它有几个明显的局限性。首先，血管被压扁，失去了它的三维血管构筑，使得空间相关性难以实现。其次，消化和物理处理组织可能无意中损害外部血管结构，如 VSMC 和周细胞，导致错误的概念细胞损失由于病理过程。

全视网膜浸润染色渗透剂，如 Triton X-100允许标记血管和血管外组织。因此，需要仔细选择用于血管标记的特异性抗体，以尽量减少血管外组织标记，使血管可视化。背景染色往往是不可避免的，尽管努力冲洗组织。此外，我们发现组织穿透的深度一般小于100微米。中央黄斑的厚度大于200微米，这使得更深的视网膜神经丛的可视化更加困难。

视网膜冷冻切片或石蜡切片可能是视网膜研究中最常用的方法。这种方法具有以下优点: 1)可以使用多种抗体进行标记; 2)可以对每个供体视网膜进行阳性和阴性对照染色切片; 3)可以研究视网膜的每一层。这绕过了视网膜组织厚度相关的抗体渗透问题，以及与深层结构共聚焦显微镜成像相关的高噪声信号。此外，视网膜切片可以使用透射电子显微镜成像，这提供了无与伦比的分辨率小细胞结构是不可能实现的使用光学显微镜。视网膜切片的折衷之处在于，对于研究者和读者来说，视网膜结构很难跨越连续切片进行跟踪，而且无法提供良好的血管树的3D 概况。

染料注射法在20世纪中叶得到了广泛的应用。注入的物质包括印度墨水和 PAS染色法(阿什顿，1953)。这种方法的优点是可以精确地显示视网膜血管疾病的非灌注模式。缺点包括在适当的压力和速度下注射的技术挑战，以确保完整的血管标记，同时保护血管不因高压而破裂。灌注液中的气泡也可能沿着通路剥离内皮细胞，并可能人为地产生“鬼血管”。

在过去的20年里，我们的研究小组已经完善了利用人类供体眼睛进行孤立眼灌注的技术。使用该技术收集的500多只眼睛的数据包含了本文讨论的大部分组织学信息。人眼单独灌注是一种类似于小动物研究中心内灌注的技术。

由于人类的视网膜是由一个视网膜中央动脉提供的，因此可以通过视网膜中央动脉或提供视网膜中央动脉的血管插管来完成视网膜脉管系统的完整标记。由于脉络膜循环由20多条睫状动脉提供，因此不可能通过单一睫状动脉的插管实现完整的脉络膜标记(Weiter 和 Ernest，1974; Yu 等，2014a，2014b)。由于灌注标记是一种血管内标记的方法，其功效不依赖于视网膜组织的厚度，能够标记即使是视网膜最深的血管结构，同时血管外组织标记被最小化。

视网膜循环的组成

视网膜循环的地形特征不均匀，表现出明显的偏心特化。

例如，提供锥形占优势的黄斑的毛细血管丛床的大脑皮质细胞结构学和形态与提供杆状占优势的外周视网膜的毛细血管丛床明显不同。

协调视网膜毛细血管床的形态特征是重要的，原因有以下几点: 1)它将增加有关微循环在视网膜生理学和疾病中的作用的知识体系; 2)它将有助于新兴技术的临床解释，促进视网膜毛细血管在体内的高分辨率可视化，作为检测视网膜疾病和监测疾病进展的手段。

4.1 黄斑视网膜循环

人类的黄斑直径约为5.5毫米。Hogan 将黄斑从中心细分为四个同心环: 中心小凹(0.35 mm 直径) ，中心凹(1.85 mm 直径) ，副中心凹(2.85 mm 直径)和周围凹(5.85 mm 直径)(Hogan 等，1971)。

黄斑负责高分辨率视觉。它是视网膜内锥体感光细胞和 RGC 密度最大的部位。

黄斑循环的结构组织用于优化营养物质-废物的交换，而黄斑的功能需求需要一个透明的光路来优化视力，这两者之间存在着利益冲突。

毛细血管密度分布的增加作为改善能量传递的一种手段可能会影响视力，并通过干扰入射光的路径而引起像差。然而，黄斑内毛细血管密度不足作为提高图像分辨率的手段，不太可能满足高密度 RGC 和其他神经元的巨大能量需求。

中心凹无血管区(FAZ)是中心凹的中心部分，没有任何血管成分。这是一个生理标志，可以在几乎每一个正常人的眼睛确定。FAZ 的大小在个体之间是高度可变的(Balaratnasingam 等，2016; Falavarjani 等，2018)。

有趣的是，在正常眼中，FAZ 的大小与最佳矫正视力之间的显着关系尚未建立(Balaratnasingam 等，2016)。然而，在白化病，DR 和视网膜静脉阻塞等疾病中(Balaratnasingam 等，2016; Lu 等，2018; Mansour 等，2021) ，FAZ 的大小与最佳矫正视力之间存在显着关系。黄斑血管密度与视力之间的关系因此在健康和疾病中是不同的。

4.2 周边视网膜循环

周边视网膜循环支持杆状优势视觉。与后极相比，周围组织更薄，神经元的大小增加，周围视网膜的密度更低(Toussaint 和 Danis，1970)。周围视网膜脉管系统的结构组织可以说具有较低的光学约束，因为它不负责高视力的视力。毛细血管层的复杂性和数量在离心方向上从黄斑到远端外周视网膜减少。在我们以前的研究中，我们已经表明，距离黄斑3mm 的偏心距由四个丛组成，距离黄斑6mm 的偏心距由两个丛组成，距离黄斑9mm 的偏心距由单个丛组成(An 等，2021)(图18)。这与3mm 神经丛(91.5 ± 24.3) ，6mm 神经丛(64.9 ± 15.7)和9mm 神经丛(44.0 ± 11.3)之间的总毛细血管密度降低有关。

外周和中周循环是重要的，因为它可以优先参与缺血性视网膜血管疾病，如后极保留 DR (An 等，2021)。当在外周视网膜观察到血管闭塞时，它常常涉及从小动脉水平到小静脉的整个血管床。此外，当有外周血管闭塞的证据时，它通常涉及小动脉和小静脉之间的所有毛细血管床。然而，我们有组织学证据显示，在一些使用人类供体眼的周围视网膜缺血的情况下，更深的毛细血管床优先受累(图19)。这一观察结果表明，黄斑血管闭塞的病理生理机制在很多方面与外周视网膜不同(Bek，2013)。推而广之，如果血管闭塞的病理生理机制在黄斑和外周视网膜之间是不同的，那么发生危及视力的并发症如黄斑水肿和视网膜新生血管的风险也将是不同的。周边视网膜血管阻塞的模式将在本文的后续章节中更详细地讨论。

糖尿病视网膜病变的表现

5.1 血管内皮功能障碍

血管内皮细胞在维持心血管稳态中起着重要作用(Rubanyi，1993)。从细胞的角度来看，血管内皮功能障碍被认为是 DM 中发生的最早的致病性改变之一(Avogaro 等，2011; De Meyer 和 Herman，1997; Tousoulis 等，2012)。内皮功能障碍是指内皮细胞丧失执行纤维蛋白溶解、血管舒张和抗血小板聚集等生理功能的能力(Avogaro 等，2011)。糖尿病患者血管内皮细胞的变化是弥漫性的，涉及心血管系统内的多个器官，包括心脏、大脑和颈动脉血管系统。内皮功能障碍是动脉粥样硬化发生的特征，动脉粥样硬化可发展为心肌梗死、中风、周边动脉阻塞性疾病和颈动脉狭窄(Daiber 等，2017; Libby 等，2006)。糖尿病血管内皮功能障碍的发病机制是复杂的，并非单一的过程。更具体地说，尽管高血糖可以改变内皮功能，但有证据表明，尽管生化环境恢复到正常血糖状态，内皮功能障碍仍可以进展(El-Osta 等，2008)。

介导糖尿病血管内皮功能障碍的高血糖以外的机制包括氧化应激，局部炎症级联和一氧化氮水平的消耗(Funk 等，2012)。

鉴于内皮功能障碍是糖尿病最早发生的血管改变之一，已经开发了一些临床试验来测量内皮活性，作为检测和预测糖尿病心血管发病风险的手段。一些常用的测试包括:

1.

反应性充血的肱动脉高分辨率超声成像-这种检查通常被称为血流介导的扩张。在这个测试中，前臂或手部缺血是通过一个充气到收缩压以上的袖带中断动脉血供而引起的。血管直径从基线期到反应性充血期间观察到的峰值的变化幅度被用作内皮功能的测量。所有受试者都不能很好地耐受这种检查，这也取决于超声操作者的技能(Deanfield 等，2007; Verma 等，2003)。

2.

外周动脉血压测量-在反应性充血之前和期间评估脉搏波振幅，反应性充血是由使用充气袖带阻塞肱动脉血流引起的。反应性充血组血流量与对照组血流量之间的计算指数代表了内皮功能的测量值。这个测试与上面描述的流量介导的扩张具有相同的局限性(Deanfield 等，2007; Verma 等，2003)。

3.

一氧化氮等血管活性物质的静脉闭塞体积描记术。在这个实验中，测量前臂或小腿解剖室闭塞后的早期体积变化，用于估计动脉流入和内皮功能障碍的比率。这种检查可能是侵入性的，有时需要肱动脉插管(Deanfield 等，2007; Verma 等，2003)。

4.

测量血栓调节蛋白、血管性假血友病因子、 E 选择素、非对称性二甲基精氨酸、细胞内粘附分子1(ICAM-1)、 C反应蛋白和铜/锌超氧化物歧化酶的血清水平。这些检测内皮功能障碍的缺点是出现假阳性和假阴性结果，以及阳性结果的特异性和敏感性有限。这种检测具有侵入性，成本高昂，其特点是在进行检测和结果返回之间存在延迟(Constans and Conri，2006; Leite et al。 ，2020)。

眼睛是为数不多的人体系统中的毛细血管循环可以直接可视化使用体内国家的最先进的临床成像。尽管使用眼部脉管系统(特别是视网膜)作为评估弥漫性全身性微血管失调的生物标志物具有明显的优势，但只有有限数量的研究利用和验证了这一概念，使其可以以有意义的方式应用于日常临床实践。对视网膜内皮细胞的扰动是 DR 最早的特征之一，这一点已经得到确认(桂等，2020; Yu 等，1998b，2005)。鉴于使用 OCTA 可以解决直径达7-8μm 的视网膜血管，应该有可能利用这种技术来研究 DM 中的内皮功能障碍(Yu et al。 ，2018,2021)。评估视网膜微血管功能障碍而不是全身性大血管疾病的明显优势有很多。OCTA 技术的主要优势在于它是一种安全、快速和可重复的检测方法，并且已经被证明可以克服目前用于评估上述内皮功能障碍的临床试验的许多局限性。在这篇文章的后续部分(第7.5节) ，我们提出了一种新的方法来检测内皮功能障碍的糖尿病使用 OCTA。

5.2 视网膜微动脉瘤

虽然内皮功能障碍是糖尿病体循环内最早发生的功能障碍之一，但视网膜微动脉瘤是 DR 最早的视网膜异常的标志性结构改变(Ballantyne 和 Loewenstein，1944; de 等，1976; Hausler 和锡拜，1961; Pope，1960)。

换句话说，视网膜微动脉瘤是全球公认的临床表现，是表征 DR 发病的第一个结构性变化。自1879年 Nettlesship 首次描述以来，围绕糖尿病微动脉瘤的病理生理学已经有几个争议(Mackenzie 和 Nettleship，1879)。关于微动脉瘤的主要争议之一是它们是否是由于血管壁外翻引起的基本结构异常，或者它们是否代表视网膜新生血管化的流产尝试(Ashton，1963)。

微动脉瘤形成的推定致病机制包括周细胞丢失，基底膜损伤，内皮增殖，毛细血管血流动力的增加和区域血管增殖生长因子的上调(Aguilar 等，2003; Ashton，1963; Cogan 等，1961a; Pope，1960; Tolentino 等，2002)。了解微动脉瘤的病理生理学非常重要，原因有以下几点:

1)

由于它们是 DR 最早的临床可识别的表现之一，延迟或阻止微动脉瘤的形成可能会阻止其他视网膜血管并发症的发展，如缺血和视网膜新生血管。

2)

了解为什么一些微动脉瘤退化(图20)可以提供新的见解，如何结构改变的 DR 可以逆转没有遗留的永久性结构损伤或视力丧失。

总之，我们的分析表明，控制毛细血管非灌注区域微动脉瘤形成和进展的途径可能与那些灌注相对保留的区域不同。我们发现，在毛细血管无灌注区域内，微动脉瘤进展的时间表可能以周细胞的初始丧失为特征，之后发生腔内扩大和炎性细胞浸润。在毛细血管无灌注区域，只有1.4% 的微动脉瘤表现为炎性细胞和周细胞的保存。最大的微动脉瘤是那些表现为腔内炎性细胞和周细胞缺乏的动脉瘤。

5.3视网膜缺血

DR 最具破坏性的后遗症之一是视网膜缺血的发展。

重要的是要记住，DR 中的血管损伤主要发生在微循环水平，视网膜内最常发生闭塞性损伤的部位是毛细血管系统(Ashton，1963; Cogan 等，1961)。在这方面，DR 的病理生理学与视网膜大血管疾病如视网膜动脉或静脉阻塞有很大的不同。视网膜缺血是 DMO 和视网膜新生血管形成发展的危险因素，这两者都是 DR 的主要威胁视力的并发症(Ramirez 等，2011; Wessel 等，2012)。这可能是因为视网膜缺血的发生引发了一系列的生化和病理通路，最终导致 VEGF 和其他促血管生成因子的上调。正如上一节所讨论的，VEGF 的上调在破坏 BRB 中起着推定的作用(Murata 等，1996; Ozaki 等，1997)。它也在病理性血管生成和新血管的发展中起关键作用(Aiello 等，1995; Miller 等，1994; Ozaki 等，1997)。尽管视网膜新生血管化是视网膜缺血最严重的后遗症之一，但应该强调的是，其他致病机制也支持 DR 中视网膜新生血管化的形成和进展作为例子，尽管综合性全视网膜光凝治疗(图33，图34)。因此，类似于 DMO，多种生化途径驱动视网膜新生血管在 DR 视网膜缺血然而是一个关键因素在这个过程中。

5.4糖尿病视网膜病变黄斑血流模式的改变

鉴于视网膜缺血是永久性的，并且是 DR 中不可逆损伤的标志性特征，因此了解缺血发展之前的血管变化将是设计任何减轻缺血发展的干预措施的关键。已有研究表明，黄斑灌注异常先于视网膜缺血的发展(Cringle 等，1993)。可能的情况是，如果在可逆性细胞损伤的状态下检测到微循环障碍，那么适当的治疗干预可以防止或延缓缺血的发展。目前，视网膜体内灌注的可视化和定量是非常困难的。然而，可以利用组织学信息推测视网膜灌注在 DR 中是如何受到干扰的。以下章节将结合我们在该领域的组织学研究讨论 DR 中的黄斑灌注异常。

5.5 中枢和外周缺血的病理学差异

组织学研究表明，周围缺血的病理学不同于黄斑缺血。诺曼 · 阿什顿1953年的报告显示，DR 患者的外周缺血常常是由于大的有序小动脉闭塞导致毛细血管床弥漫性不灌注所致(阿什顿，1953)。他还发现，在正在闭塞的毛细血管网络的动脉一侧，一些眼睛显示动脉和静脉毛细血管系统之间的血管连接扩张。这些组织学观察结果在 Bresnick 等人的临床血管造影报告中得到验证，显示 DR 中视网膜小动脉水平的阻塞，在闭塞部位下游的外周视网膜内毛细血管床严重闭塞(Bresnick 等，1975)。

相比之下，我们的组织学评估表明，黄斑内的血管闭塞主要涉及选择性毛细血管段和/或毛细血管床。在我们对100只 DR 眼的调查中，我们还没有看到由于小动脉水平的闭塞而导致黄斑毛细血管床弥漫性不灌注的模式，即在黄斑缺血的面部，几乎总是有一些 SCP、 ICP 或 DCP 的毛细血管段明显灌注。综上所述，临床和组织学资料表明，周围性视网膜缺血的致病机制可能与中央性视网膜缺血不同。上文提供了与周围血管和黄斑血管闭塞相关的组织学改变。因此，DR 中血管闭塞的治疗可能需要根据血管闭塞的表型模式进行调整。

视网膜循环的临床影像学表现

1.眼底彩照

除检眼镜外，彩色摄影是检测和记录 DR 并发症的最古老方法。彩色摄影的主要优点是安全、快速、相对便宜和广泛使用。它也是记录视网膜随时间变化的时间顺序的一个极好的工具，并作为一个教育工具为患者。

最早的委员会之一，以促进彩色摄影的应用，努力特点 DR 在一个标准化的方式是1968年艾利研讨会(ETDRS，1969年)。分类模式随后被认为是 Airlie-House 分类(Goldberg 和 Jampol，1987)。七个标准的摄影领域被修改，随后被用于糖尿病视网膜病变研究(DRS)和 ETDRS (ETDRS，1981)。ETDRS 研究的结果仍然是临床上分类 DR 严重程度的金标准。在这个系统中，建立了彩色摄影标准的存在出血，硬渗出物，微动脉瘤，IRMA 和新血管化的视盘和/或视网膜。选择摄影领域是因为它们对视觉功能的重要性，例如视盘和黄斑，以及它们参与早期 DR，例如黄斑的颞区。

虽然7场彩色摄影允许一个标准化的方法分级 DR 它是相关的一些限制。最重要的是，彩色摄影的空间分辨率不允许视网膜毛细血管的清晰可视化。在本文中，我们提供了强有力的证据来强调可视化毛细血管循环以便早期检测 DR 的重要性。彩色摄影用于评估毛细血管的局限性在临床试验中使用彩色摄影的方式中得到了例证。在 DRS 中，彩色摄影被用来定义新血管形成或玻璃体出血的发生的高风险 PDR (ETDRS，1987)。ETDRS 系列报告评估了各种治疗策略，主要是激光治疗黄斑水肿。彩色摄影在 DR 最早期阶段的治疗中应用有限，在这个阶段，预计干预措施将提供更大的机会来减少威胁视力的并发症的发生。

2.荧光素血管造影（FA）

视网膜染色血管造影一直被认为是评价视网膜脉管系统的金标准技术。Novotny 和 Alvis 是开发这种技术的两名医学学生，并在1961年发表在《循环》(Novotny 和 Alvis，1961)中报告了这种方法在临床实践中的应用。自该报道以来，荧光素已成为视网膜血管造影中应用最广泛的染料，吲哚菁绿血管造影(ICGA)在视网膜血管疾病研究中的临床应用要少得多。

除了说明视网膜循环的结构特征外，FA 还有许多其他方面共同传达关于视网膜和体循环状态的重要信息(图48)。例如，手臂到视网膜转运时间的显着延迟可以表明伴随的颈动脉疾病，并且需要使用颈动脉超声检查或基于对比的血管造影作为预防中风的措施来研究颈动脉血管系统(Sarkies 等，1986)。此外，FA 是研究 BRB 完整性，特别是黄斑部完整性的精确方法。黄斑水肿经常会出现黄斑内的荧光素渗漏，如果评估 OCTA 或黄斑的彩色摄影图像，很容易忽略这一点。视网膜血管弥漫性染色和深部毛细血管循环渗漏可能提示后段血管内皮生长因子浓度升高，并可能预示这些患者对玻璃体内抗 VEGF 治疗有更大的反应。FA 也提供了一种可靠的方法，检测毛细血管缺血设置 DR 以及量化的程度缺血。由于上述原因，包括 OCTA 在内的新型血管造影技术还没有超越 FA 的显著优势。因此 FA 仍然在 DR 的管理中发挥着重要作用，尽管 OCTA 技术的引入，FA 并不是一个过时的调查，仍然被眼科医生广泛使用。

3.OCTA

OCTA 是目前临床应用于视网膜循环成像的最新成像技术。在 OCT 平台上开发的 OCTA 的一个主要优点是它提供了视网膜循环的深度分辨图像。有许多优秀的文章概述了 OCTA 的原则，因此我们不会在本报告中重复相同的信息(Kashani 等，2017; Makita 等，2006; Spaide 等，2018)。简而言之，使用 OCTA 的血流通过比较连续获得的 OCT B 扫描和计算每个像素的扫描之间的差异来可视化，突出了理论上应该只是脉管系统的变化区域。OCTA 是基于这样一个前提: 在一个非常短的时间间隔内，发生在组织区域内的唯一结构性变化是视网膜循环中细胞的运动。OCTA 的一个主要优势是，它允许视网膜循环的可视化标签免费，这是视网膜脉管系统的可视化没有管理的荧光素或其他染料。因此，这是一个无风险的程序，是迅速和耐受性良好的病人。使用 OCTA 获得的血管信息可以在正面和横面上显示出来。

OCTA 的一项重要发展是引进超宽频系统。一些商业 OCTA 系统已经促进了在单个眼底图像中高达80度视野的可视化(Khalid et al。 ，2021)。UWF-OCTA 的主要优势在于它捕捉到了缺血和新生血管化的区域，而这些区域在单独的临床评估中可能会被忽略。这是一个显着的优势，例如，在妊娠患者的评估中，妊娠是 DR 进展的重要危险因素，并且由于在怀孕期间倾向于避免手术(Chew 等，1995; Temple 等，2001)。Sawada 等比较了在 DR 中 UWF-FA 和 UWF-OCTA 上观察到的视网膜非灌注和新生血管形成(Sawada 等，2018)。使用 UWF-FA 作为金标准，他们报道 UWF-OCTA 检测非灌注的灵敏度为98% ，UWF-OCTA 检测新血管形成的灵敏度为100% 。

未来方向

到目前为止，我们已经提出了几条证据来证明视网膜微循环的变化与 DR 的病理生理学有着内在的联系。因此，保留毛细血管和内皮功能是预防 DR 视力丧失的关键策略。在本节中，我们将重点介绍 DR 领域中需要更多研究重点的领域，以提高我们对这种复杂疾病的理解，并且能够更早地检测疾病诱导的结构和功能变化，这些变化导致视力丧失。

7.1 临床组织学相关性研究的重要性

多模式视网膜成像是 DR 管理的重要组成部分。临床实践中常用的主要成像工具包括结构 OCT、彩色摄影、 FA 和 OCTA。

成像技术有了很大的进步，现在可以研究视网膜的几乎细胞样的细节。例如，许多商用结构 OCT 设备的空间分辨能力已经提高到6微米以上，并允许对不同的黄斑带进行精确的可视化。OCT 技术的这一特性已经被用来提高我们对老年黄斑变性(AMD)的理解。最近在 AMD 领域的大部分工作已经由美国阿拉巴马州伯明翰大学的克里斯汀 · 柯西奥实验室完成。他们的集体工作提高了我们对 AMD 进展和萎缩发展中的 RPE，Drusen 和新血管形成的理解(Gambril 等，2019; Li 等，2018; Tan 等，2018; Tong 等，2016)。最重要的是，这项研究已经确定了临床医生能够识别黄斑萎缩发展前兆的方法。他们的工作还验证了 OCT 与不同类型的黄斑新血管形成的相关性，并大大提高了临床医生以极高的精确度解释成像技术的能力(Dolz-Marco 等，2018; Litts 等，2016; Tong 等，2016)。Curcio 团队的大部分临床组织学相关工作都采用了人类捐献者眼睛的离体 OCT 成像，然后进行死后组织处理。他们的工作促进了 OCT 特征和高分辨率组织学之间精确的点对点关联。类似的临床组织学相关工作，利用 OCT 将显着有利于领域的 DR，但目前还缺乏。

7.2 在糖尿病中调和肾脏与视网膜的致病联系

糖尿病肾病是全球发病的主要原因。近45% 的1型糖尿病患者在其一生中会出现临床上明显的糖尿病肾病(Gross et al。 ，2005)。预测糖尿病肾病和 DR 发展的危险因素有很大的重叠。两种疾病表现共同的危险因素包括全身性高血压、血糖控制不佳、疾病持续时间和怀孕(Davis，1992; Gross 等，2005)。在糖尿病肾病中还可以看到两个与 DR 重叠的关键组织学特征:

1.

肾小球基底膜(GBM)增厚-这是表征糖尿病肾病最早的变化之一，通常发生在发病后1-2年内(Tsilibary，2003)。GBM 增厚先于微量白蛋白尿。类似于视网膜周细胞，肾足细胞包围肾毛细血管，与 GBM 增厚有内在联系(White et al。 ，2002)。受损的足细胞被认为在破坏 GBM 的合成和降解途径之间的平衡中起关键作用。

2.

肾传入和传出小动脉的透明化和内皮损伤-透明化是由于肾小球内皮细胞，GBM，肾小球簇和 Bowmans 胶囊之间血浆蛋白的渗出和积累(Smith，1955)。

考虑到 DR 和糖尿病肾病在临床危险因素和组织学特征上的重叠，直觉上认为其中一个的自然过程可能调节另一个。Klein 和他的同事研究了糖尿病肾病的组织学测量和使用彩色摄影分级的 DR 的严重程度之间的关系(Klein，2006)。在控制糖尿病病程和糖化血红蛋白(HbA1c)水平后，他们发现 DR 的严重程度与 GBM 宽度和组织学分级的肾小球病变指数显着相关。肾功能减少与晚期视力障碍糖尿病肾病严重有关(图66)。Park 及其同事通过对肾功能和蛋白尿的系列测量评估了彩色摄影中临床 DR 之间的关系(Park et al。 ，2019)。他们的研究揭示了两个重要的发现: 1)更大比例的慢性肾脏疾病患者表现出 DR 的进展; 2)调整糖尿病持续时间后，糖化血红蛋白、基线肾功能和使用血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的慢性肾脏疾病进展的风险与 DR 的严重程度独立相关。具体而言，NPDR 患眼的慢性肾病进展风险是无 DR 患眼的2.9倍，PDR 患眼的慢性肾病进展风险是无 DR 患眼的16.6倍。图66提供了一个说明性病例。此外，在这种情况下，尽管激光或手术干预通常有助于降低视网膜病变进展的风险，但视网膜病变的进展仍然相当常见(图67)。

考虑到在 DM 中，肾脏疾病的发病机制与视网膜疾病以一种复杂的方式联系在一起，使用视网膜生物标志物可以预测发生肾脏疾病并发症的风险，反之亦然。尽管我们已经提供了几条证据来证明当不可逆的终末器官损伤已经发生时的联系，例如在 PDR 或慢性肾脏疾病中，几乎没有肾脏或视网膜生物标志物可以预测早期器官功能障碍。眼睛的光学特性使视网膜毛细血管的可视化和延伸，检测内皮功能障碍。将来自最先进的高分辨率视网膜成像技术的内皮功能障碍和视网膜灌注指标与新的糖尿病肾病生物标志物联系起来，可以进一步扩展我们对糖尿病视网膜-肾脏病理联系的理解。更具体地说，如果使用临床影像检测到的视网膜内皮功能障碍可以用来预测肾功能障碍的风险和程度，它可以提供一种非侵入性检测糖尿病肾病的方法。这是一个值得进一步探讨的重要概念，因为它可以避免为检测糖尿病肾病而进行侵入性、昂贵和耗时的尿液和血液检测。最终，这些技术可以帮助降低发病率，降低医疗成本，改善肾脏和视力的结果。

7.3 协调糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病之间的关系

糖尿病周围神经病(dPN)是糖尿病最常见的并发症之一(Dyck et al。 ，1993)。DPN 发生的重要危险因素包括 DM 的持续时间、年龄增长、 HbA1c 水平和 DR (Liu et al。 ，2019)。经过23年的平均随访，33% 的糖尿病控制和并发症试验(DCCT)患者出现 DPN (Braffett et al。 ，2020)。DPN 的病理生理学是复杂和多因素的(Feldman 等，2017)。微血管紊乱在 DPN 发展中的重要性可以通过组织学研究得到证实，这些研究揭示了人类 DPN 标本中神经内膜毛细血管内的内皮细胞增生和肥大，基底膜增厚，管腔狭窄和周细胞丢失的证据(Malik 等，1989,1992; Thrainsdottir 等，2003; Yasuda 和 Dyck，1987)。

DPN 和 DR 之间的致病性联系已有报道。Deghani 等研究了1型糖尿病患者 DPN 与 NFL 减少之间的关系。他们发现，与无 DPN 患者相比，DPN 患者的视神经上部 NFL 明显变薄(Dehghani 等，2017)。Srinivasan 及其同事表明，使用 OCT 测量的视网膜厚度在 DPN 眼中的中央凹和周围凹显着降低(Srinivasan 等，2017)。在横向研究中，Rasheed 等分析了500例2型糖尿病患者，发现86% 的 DR 患者也表现为 DPN (Rasheed 等，2021)。巴尔等人评估了超过1000名患有葡萄糖耐受不良和空腹血糖受损的受试者，发现在调整了年龄，性别，高血压，降脂药物和总胆固醇的影响后，神经病变评分与白蛋白尿和视网膜病变独立相关(巴尔等人，2006)。

DR 和 DPN 之间的联系可能并不直观，因为视网膜中的 NFL 和 RGC 变薄代表了中枢神经系统的变化，而 DPN 是一种周围神经疾病。从解剖学的角度来看，NFL 也是一个无髓鞘的结构，而 DPN 通常涉及的神经是有髓鞘的雪旺细胞，如腓肠神经。DR 和 DPN 中微血管紊乱之间的关联难以研究，因为 DPN 的严重程度也被其他疾病途径如神经中晚期糖基化终产物的多元醇途径激活和积累所混淆(Peng 等，2020)。皮肤的微循环可以通过视频毛细管镜直接观察到，同样，视网膜的微循环也可以通过 OCTA 和其他血管成像方式观察到。这为研究两个系统之间微循环变化的关联提供了一个独特的机会。然而，这样详细的研究还有待进行。Uyar 等研究了使用彩色摄影和 OCT 测定的甲襞视频毛细管镜和 DR 之间的关系(Uyar 等，2016)。发现 PDR 患者甲襞毛细血管镜检查异常显着高于 NPDR 或无 DR 患者，然而，本研究没有专门研究视网膜毛细血管的结构或动态变化。Li 及其同事指出，血流介导的扩张(FMD)等内皮功能障碍的动态测量可能与 DPN 的严重程度相关(Li et al。 ，2022)。他们发现，只有2% 的 FMD 测量值 > 7% 的患者表现出严重的神经损伤，而70% 的 FMD 测量值 < 4% 的患者表现出严重的神经损伤。正如本报告前一部分所概述的，手足口病研究可能是主观的和侵入性的。通过研究内皮功能障碍的视网膜毛细血管成像生物标志物与 DPN 严重程度之间的关系，可能有可能确定新的视网膜生物标志物，预测某些亚型 DPN 的发病和自然进程。

7.4 定义神经胶质病变在糖尿病视网膜病变中的作用

神经胶质细胞是中枢神经系统中支持神经元的关键细胞。神经胶质细胞的密度比神经元的密度高出几个数量级，在人类皮层中大约有600亿到160亿个神经元(Azevedo et al。与神经元组织相比，神经胶质过多也是视网膜和视神经的特性(Balaratnasingam 等，2014)。

人类视网膜含有三种类型的胶质细胞: 星形胶质细胞，Muller 细胞和小胶质细胞(Reichenbach 和 Bringmann，2020; Vecino 等，2016)。星形胶质细胞和穆勒细胞被归类为大胶质细胞。星形胶质细胞主要定位于 NFL 和 GCL。Muller 细胞是横跨 ILM 和 OLM 之间的整个视网膜厚度的放射状神经胶质细胞。人视网膜中有近500万个 Muller 细胞，Muller 细胞的细胞体位于 INL。顾名思义，小胶质细胞比大胶质细胞小得多，类似于血源性吞噬细胞(Vecino et al。 ，2016)。它们在 GCL、 IPL、 OPL 及血管周围的浓度最高。总的来说，视网膜神经胶质维持神经元的活力和支持视觉功能。总的来说，视网膜大胶质细胞维持视网膜神经元的健康和代谢活动，而小胶质细胞主要是维持视网膜稳态的先天性免疫细胞。眼科文献包括许多详细的报告，提供有关视网膜神经胶质结构和功能的非常具体的信息(Coorey 等，2012; Reichenbach 和 Bringmann，2020; Sorrentino 等，2016; Vecino 等，2016)。这些信息将不会在本节中重复，并且超出了本文的范围。

鉴于视网膜神经胶质在维持视网膜稳态中的关键作用，预计它们也在 DR 的病理生理学中发挥不可或缺的作用。然而，关于这个问题的科学信息相对缺乏。在 DR 的不同阶段对视网膜神经胶质的功能和结构变化进行系统的评估将是我们进一步了解这种复杂疾病的基础。我们现在将提供一个什么已经在这个领域的报告摘要。

7.5视网膜的灌注和氧气处理

有关视网膜微循环的灌注和血流速度的信息对于低估视网膜神经元的氧输送至关重要。

研究人眼视网膜灌注的一个主要挑战是视网膜灌注的时空特性有显著的变化(Yu et al。 ，2019a)。视网膜灌注出现巨大瞬间变化的一个原因是在明视和暗视条件下维持视觉功能所需的能量快速波动和不同。

与中枢神经系统的许多脉管系统不同，视网膜缺乏自主神经支配，依赖于局部机制来调节血流。神经血管偶联是一个经常与功能性充血交替使用的术语，指的是一种机制，通过这种机制，局部血流量的即时变化可以在神经组织内响应功能活性的变化而发生(Hamilton 等，2010; Iadecola，2017; Lecrux 和 Hamel，2011)。前馈信号和代谢负反馈信号的组合有助于神经血管耦合。视网膜神经胶质细胞是神经血管偶联的主要贡献者(Metea 和 Newman，2006; Paemeleire，2002; Reichenbach 和 Bringmann，2013)。

人类视网膜血管树中功能性充血的确切位置仍然存在争议。Kornfield 和 Newman 使用啮齿动物视网膜进行了功能性充血的研究，并观察到它主要由小动脉介导(Kornfield 和 Newman，2014)。Curtis 及其同事还使用分离的视网膜脉管系统进行了大量的离体工作，以证明视网膜小动脉通过调节管腔直径在调节血流中起关键作用(Curtis 等，2018)。Mishra 和 Newman 的研究表明功能性充血在1型糖尿病中以时间依赖的方式减弱(Mishra 和 Newman，2010)。使用 STZ-啮齿动物 DR 模型，他们发现光诱发的小动脉扩张在疾病发生7个月后减少了58% 。在发病4个月后，与对照组相比没有变化。通过研究 Muller 细胞和星形胶质细胞在细胞内钙增加后的血管舒缩反应，他们能够得出结论: 血管系统的异常胶质调节是功能性充血丧失的关键机制。他们能够证明糖尿病视网膜中胶质细胞诱发的血管舒张减少，而胶质细胞诱发的血管收缩增加。在随后的报告中，Mishra 和 Newman 表明，通过静脉注射氨基胍可以逆转糖尿病功能性充血的一些丧失(Mishra 和 Newman，2011)。由于氨基胍是一种可诱导的一氧化氮合酶抑制剂，可降低一氧化氮浓度，他们得出结论，这种治疗恢复了视网膜的神经血管耦合机制。

然而，啮齿动物和人类视网膜之间存在着重要的解剖学差异，即啮齿动物的视网膜缺乏一个专门的黄斑。在本报告的早期部分，已经提供了组织学证据，表明在人眼中可能存在其他视网膜灌注的控制点，如 αSMA 蛋白质的分布所证明的(An 等，2020b)。ΑSMA 在 SVP 和 ICP 的浓度越高，表明这些微循环床比二氯丙醇具有更大的自动调节能力。小静脉和静脉交界处 αSMA 浓度的增加也提示该部位可能具有括约肌样功能并调节血液流出血管床。

参考

Balaratnasingam C, An D, Hein M, Yu P, Yu DY. Studies of the retinal microcirculation using human donor eyes and high-resolution clinical imaging: Insights gained to guide future research in diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 2023 May;94:101134. doi: 10.1016/j.preteyeres.2022.101134. Epub 2022 Oct 29. PMID: 37154065.