AAV在肠道中的应用策略

肠道AAV研究简介

肠道是人体重要的消化器官和排毒器官，同时也是重要的免疫器官，有将近70%以上的免疫细胞分布在肠黏膜上，承担着人体70%以上的免疫功能。肠道相关疾病发病机制的破解和治疗所面临的挑战，使得研究肠道基因靶向技术研究迫在眉睫。虽然目前已有大量利用病毒载体进行基因转移的临床前数据，但在肠道中的研究仍然较少。对于肠道的早期研究主要集中在粘膜转导上，但由于肠道管腔条件恶劣及肠细胞代谢周转率较高导致其成功率较低。重组腺相关病毒（rAAV）因其血清型种类多、表达时间长以及低免疫性的特点使肠道基因转移的效率得到提高，但是如何提高AAV在肠道中转导效率和特异性细胞靶向仍是肠道基因治疗需要克服的障碍。

肠道AAV血清型和启动子的选择

AAV2、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10对肠道组织的转导效率较高，其中AAV7对小肠的感染效率相对较高，AAVrh10已被证明能够在肠道中长效表达外源基因，尤其是在结肠中。目前研究中应用较多的血清型是AAV9，启动子通常选择广谱型启动子CMV。

小肠（SI）结肠（Colon）中AAV血清型趋向性和转导效率比较

（Steven P., Annette M., Stacy P., et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012.）

AAV在肠道中注射方式

肠组织常见的注射方式有尾静脉注射、腹腔注射、口服、灌肠和肠系膜上动脉（SMA）注射等。其中尾静脉注射和腹腔注射作为系统性给药方式，虽然操作简单，损伤性小，但是注射量较大，特异性不强。口服和灌肠，都属于腔内给药，主要是黏膜的转导，但由于胃酸及肠蛋白水解酶等的中和作用，因此这两种方式的转导效率并不高。在这几种注射方式中，SMA注射效果较好，但对实验条件和操作手法要求较高，对小鼠伤害性也较大。腔内给药和系统性注射的操作相对简单，此处不进行赘述，下面分享SMA注射的操作步骤供参考：

肠道AAV SMA注射步骤

1.将小鼠以右侧卧位固定在手术板上，保持四肢松弛，放入含2-4.5% O2的异氟醚诱导室进行麻醉。小鼠深度麻醉后，将其放在手术台上，对小鼠手术区域做去毛及消毒处理。

2.手术开始前，皮下注射丁丙诺啡进行手术镇痛；沿左腋线最后一个肋间隙和肋下区域注射布比卡因进行局部镇痛。

3.沿着腋线和侧腹，在脾脏区域的左侧皮肤上开一个1-2 cm的切口，切开腹外斜肌，使用微型牵引器将皮肤和腹壁固定，并用温盐水纱布覆盖小肠防止缩回，暴露SMA。

4.在放大20倍的情况下，将SMA轻轻地从腹膜后剥离，在SMA的近端接头周围放置一个小的稳定接头连接注射针，使用微血管夹暂时切断腹主动脉的血液供应。

5.将定制33号1/2”针头连接到250μL汉密尔顿TLL气密性进样针注射器上，轻轻插入SMA进行病毒注射。将固定带轻扎血管，防止注射部位泄漏。

6.注射后立即取下针头，缝合注射部位。取下固定带和微血管夹，使血液回流至小肠。使用无菌棉签轻轻按压注射部位进行止血。

7.在腹腔内注射1mL无菌温盐水后，对小鼠进行缝合。

8.术后每15min对小鼠进行一次监测，直到小鼠能够腹卧。每2小时对动物进行一次监测，直至放回笼中。