生物化学考研整理第二十章：常用分子生物学技术的原理及其应用
第二十章：常用分子生物学技术的原理及其应用
第一节：分子杂交与印迹技术
分子杂交技术：利用DNA变性与复性这一基本性质，结合印迹技术和探针技术，可进行DNA和RNA定性或定量分析
（一）印迹技术
广泛用于DNA，RNA和蛋白质的检测
（二）探针技术
探针：是指带有特殊可检测标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核苷酸序列互补结合，因此可用于检测核酸样品中存在的特定基因
二：印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹
DNA样品经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区段的凝胶在变性溶液中处理后，再DNA分子转移到nc膜上并使之固定，即可用于杂交反应。DNA印迹技术主要用于基因组DNA的定性和定量分析。
（二）RNA印迹
与DNA印迹原理相同，但转移前无需进行限制性内切酶切割，主要用于检测某一特定组织或细胞中mRNA的表达水平
（三）蛋白质印迹
混合蛋白质先用聚丙烯酰胺凝胶电泳分开，在将蛋白质分子转移到nc膜上，再用第一抗体与膜上蛋白质分子结合，然后用放射性核素标记的第二抗体与之结合，最后用放射自显影技术来检测蛋白质区带的信号。蛋白质印迹技术用于检测样品中特异性蛋白质的存在及特异性蛋白质的半定量分析等
第二节：PCR技术的原理与应用
Pcr=聚合酶链反应：可将微量的目的DNA片段大量扩增。
一：pcr技术的工作原理
Pcr：以需要扩增的DNA分子为模板，在引物和DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制机制，完成DNA的复制。重复这一过程，可是目的基因DNA片段的到扩增
过程：
1.变性：将反应体系加热到94度，使模板DNA双链完全变性称为单链
2.退火：将温度下降到适宜温度，使引物与模板DNA结合
3.延伸：温度升高至72度，DNA聚合酶以dntp为底物催化DNA的合成反应
以上三个步骤为一个循环，多次循环即可达到扩增DNA片段的目的。
基因文库和cDNA文库有何不同？为什么要建立cDNA文库？
基因文库是指整套基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和，cDNA文库是指细胞全部mrna经逆转录成cDNA并被克隆的总和，cDNA组成特点是不含内含子和其他调控序列。
真核生物的基因是断裂的，需经过rna转录加工才能使编码序列拼接在一起，真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有加工成熟的mrna经逆转录合成的cDNA接上原核生物表达控制元件才能在原核生物中表达。另外，真核生物细胞中只有一小部分mrna表达，mrna的稳定性差，因此，需构建cDNA文库，用于基因表达等方面的研究。
第四节：生物芯片技术
一：基因芯片
是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一个位点的荧光信号序列做出检测，比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。
二：蛋白质芯片
将高度密集排列的蛋白质分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白质样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
