何光存教授PNAS发文点评害虫防治中的叶绿体工程

迄今为止，大约鉴定了100万种昆虫，其中有一半是食草昆虫，这些昆虫对农作物造成了严重的危害。尽管人们在害虫防治的过程中，付出了巨大的努力，甚至是使用了数十亿磅的化学杀虫剂，但是在全球范围内，尤其是在发展中国家，害虫依然是造成作物损失的关键因素。随着全球变暖这一影响不断加剧，温度每升高一度，产量损失将增加10%至25%。因此，我们需要制定创新、有效、环保的作物保护战略以保障全球粮食安全。其中一种新兴的作物保护方法是将叶绿体作为“转质体” 修饰其潜在位点，从而保护植物免受植食性昆虫的侵害。

叶绿体来自蓝细菌，包含自己的基因组(质体DNA)，这为通过利用同源重组(HR)精确插入的转基因技术提供了机会。与核基因组不同的是，叶绿体基因组缺乏表观遗传效应，并且在植物细胞中以高拷贝数存在。因此，叶绿体为导入基因的超高水平表达提供了可能。利用这种方案，用于害虫控制的转质体技术的第一个应用案例是在烟草叶绿体中表达苏云金芽孢杆菌cry1A(c)基因。转质体烟草植物中积累了大量的cry1A(c)，其表达产物可达到总可溶性蛋白的3-5%，并且，这种转质体烟草植物对几种害虫呈现了强抗性。除了烟草，表达cry基因的转质体大豆和杨树也显示出强烈的杀虫活性。  

另一种新兴的害虫控制方法使用RNA干扰(RNAi)，这是一种存在于几乎所有真核生物中的调节机制，其中双链RNA (dsRNA)产生小干扰RNA(siRNA)，介导具有互补序列的信使RNA (mRNA)的破坏，从而沉默感兴趣的基因。当靶向必需昆虫基因的dsRNA在植物中表达并在喂食后通过肠道被昆虫吸收时， RNAi抑制靶向基因的表达，导致害虫生长受损和死亡。Mao等人和Baum等人最早描述了利用整合到核基因组中的转基因表达的RNAs来控制害虫的基于RNAi的策略。

昆虫RNAi需要有效摄取长dsRNAs或发夹RNA(hpRNAs)。然而，在细胞核中表达的dsRNA可能被植物的内源性RNAi机制加工成siRNA，降低了其饲喂给昆虫时的效果，因此，这种方案在田间可能提供不了足够的保护。植物叶绿体缺乏RNAi机制，使它们非常适合表达dsRNA来实现昆虫中的RNAi。事实上，张等人通过在马铃薯叶绿体中表达dsRNA证明了这一方案在害虫控制策略中的可行性。

农业害虫为了适应不同的食物来源，进化出了不同的进食方式。在PNAS这项研究中，Wu等人使用叶绿体表达的dsRNA来控制非咀嚼式口器昆虫西花蓟马（WFT）; 西花蓟马是一种破坏性极强的害虫，同时，它还是一种传递病毒的载体(图1)。西花蓟马具有刺吸式口器，用来摄取植物细胞并吸食细胞内容物，造成植物细胞崩溃，损害植物生存。此外，WFT传播多种植物病毒，例如番茄斑萎病毒，该病毒每年在全世界造成超过10亿美元的损失。WFT的化学防治需要使用喷雾设备进行多次叶面喷洒，以确保良好的覆盖和渗透到蓟马取食的部位。同时，大多数WFTs在土壤中化蛹，所以还必须向地面施用杀虫剂。对主要杀虫剂的耐药性的产生也使利用化学方法控制WFTs具有困难。

蓟马摄取包括叶绿体在内的植物细胞的内容物，说明转质体dsRNA可能是一种有效的防治策略。为了证实WFT能在叶绿体中摄取dsRNA，分别以表达棉铃虫NADH 脱氢酶泛素黄蛋白2基因dsRNA的人工饲料、野生型(WT)植物和跨质体烟草植物喂食并进行RT-PCR，结果表明，这些昆虫取食转基因植株叶片时，会吸收叶绿体表达的dsRNA。

接下来，Wu等人构建了含有dsRNAs和hpRNAs的结构体，靶向WFT的四个关键基因:ACT、TUB、VAT和SNF。这些构建物被转化到叶绿体基因组或核基因组中，分别生成跨质体和核转基因植株。据估计，dsRNAs占转基因植株总RNA水平的约0.4 ~ 1%，hpRNAs占转基因植株总RNA水平的约0.4 ~ 0.8%。令人惊讶的是，transplasomic系的dsRNA和hpRNA水平比核转基因植物高4个数量级。3天后，与野生型和对照相比，取食表达dsRNA或hpRNA的转基因植株后，4个基因均被显著抑制。而大多数取食核转基因株系的WFT中，目的基因的表达没有显著影响。

作者通过生物测定和检查植物症状来评估转基因植物和转基因植物对WFT的抗性水平。他们观察到，与野生型植株相比，取食转基因植株叶片的幼虫死亡率明显更高。转基因株系的抗虫性比核转基因株系强得多。叶片损伤分析验证了这些品系的抗性水平。与转基因植株相比，WFTs对野生型和对照植株叶片的损伤要严重得多。对整株幼苗的表型分析证实，跨质体植株的抗性越强，对WFTs的防治效果就越好，这可能是由于叶绿体中产生了高水平的dsRNA和hpRNA。

编码具有发夹结构的内含子剪接RNA 的基因构建体可以提高RNAi 的效率。表达以棉铃虫乙酰胆碱酯酶基因为靶点的hpRNAs的转基因植株对昆虫取食表现出较强的抗性。叶绿体表达的dsRNA和hpRNA有效地抑制了目标基因，导致昆虫高死亡率。然而，hpRNA的构建引起叶绿体基因组的不稳定性，这表明dsRNA是更好的跨质体RNAi。除了白斑翅目外，许多其他目昆虫也是经济作物和粮食作物的害虫; 最著名的是Stenchaetothrips biformis,Scirtothrips dorsalis,Thrips alliorum 和Haplothrips tritici。Wu等人提供了一种很有前途的策略来控制蓟马和其他非咀嚼式口器的害虫，这是令人兴奋的。

使用跨质体RNAi方法的一个挑战是扩大宿主范围。叶绿体转化已在20多种开花植物中报道。然而，到目前为止，只有不到10个物种可产生后代。已成功应用叶绿体工程的植物是茄科植物，包括烟草、番茄、马铃薯、茄子和辣椒。将转基因RNAi技术推广到谷物上，将提高我们控制严重害虫的能力。通过对叶绿体生物学的基础研究和叶绿体转化技术的突破，可以成功转化抗性谷物的叶绿体。

研究人员正在使用各种方法来改善谷物和其他植物的叶绿体工程。一般来说，谷物的叶片是不能培育和再生的。愈伤组织通过胚或幼穗分化，在含有2,4-二氯苯氧乙酸的培养基中培养。因此，培养过程中会发生质体DNA缺失。愈伤组织细胞中的质体可能不能胜任外源DNA的整合。诸如调节形态发生基因的表达等方法可以增强叶片和叶肉原生质体的再生能力，并提高叶绿体在谷物中的能力。长期以来Biolistics一直是将 DNA 递送到叶绿体中的唯一可重复方法。然而，最近引入了一种通过纳米颗粒将质粒 DNA 递送到叶绿体中的新策略。叶绿体信号肽可以引导装载化学物质的纳米材料进入叶绿体。Minisynplastomes 可以为将外源 DNA 输送到叶绿体中提供工程平台，这一最新的 DNA 递送工具将提高其他作物中稳定叶绿体转化的能力和效率。

HR是将外来DNA整合到叶绿体基因组的关键步骤。HR取决于所携带的外源DNA序列与目标整合位点是否相同。全面了解作物叶绿体基因组的基因序列及其多样性，将有助于高效的叶绿体工程系统的开发。在过去的几十年里，筛选同形植物的选择程序没有太大变化。尽管已经尝试了几种抗生素抗性基因，链霉素30-腺苷酸转移酶基因(aadA)仍然是叶绿体转化中使用最多的选择标记基因。最近的一项研究显示，编码一个质体靶向乙酰辅酶A羧化酶的ACC2的零突变会导致对大眼霉素的过敏。acc2背景下的叶绿体转化效率比对照提高了约100倍，为抗性作物的叶绿体工程提供了有价值的信息。随着抗虫基因的使用和核转化，叶绿体工程可能产生新的机会，以帮助保障粮食安全、人类健康和农业生态系统。

原文链接：

https://doi.org/10.1073/pnas.2120081119.