免疫荧光染色 学习笔记

免疫荧光 (Immunofluorescence, IF) 是一种用于检测以及识别细胞和组织中蛋白质和其他分子的亚细胞分布和迁移的强大检测技术,可用作免疫组织化学 (IHC) 或免疫细胞化学 (ICC) 中使用的传统显色标记的替代物。通过使用多种标记物的二级抗体，能够研究感兴趣蛋白的共定位，这是不能通过常规IHC或ICC实现的。IF优势在于可同时分析许多目标蛋白，同时生成大量亚细胞定位的准确数据。

实验原理：

IF是根据抗原抗体反应原理，先将已知抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光，可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

直接法IF使用带有偶联荧光染料（共轭抗体）的一级抗体，间接法IF需同时使用可结合靶标抗原一抗和偶联荧光染色的二抗。

实验流程：

1. 样本前处理（封闭前处理）

1.1 细胞样本

i）细胞准备

①单层生长细胞：在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗涤；

②悬浮生长细胞：取对数生长细胞并用PBS离心洗涤，之后用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

ii）固定：根据需要选择适当的固定剂（如多聚甲醛）固定细胞，固定完毕的细胞可置于含叠氮化钠的PBS中4℃保存。固定后用PBS洗涤3次。

iii）通透：使用固定剂固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质，并控制好通透的时间。通透后用PBS洗涤3次。

1.2 石蜡切片样本

i）烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上（一般用不锈钢的，做跟铁染色相关的可用塑料的），将其放入适宜温度恒温箱中烤片适宜时间，并同时将脱蜡液1缸一起放入恒温箱中。

ii）脱蜡水化：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温。冷却一段时间后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3，也可以选择梯度浓度（高浓度到低浓度）乙醇的顺序依次将石蜡切片放入缸中适宜时间。脱蜡水化后用流水清洗切片。

iii）抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火加热适宜时间后停火适宜时间，再转中低火加热适宜时间（此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片）。离开热源自然冷却后，将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次。(修复液和修复条件根据组织来确定）。

1.3 冰冻切片样本

i）固定：冰冻切片在适宜温度下烘烤适宜时间，控干水分，置于多聚甲醛中固定适宜时间。PBS缓冲液中晃动洗涤3次，每次5分钟。

ii）抗原修复：同石蜡切片。

iii）画圈：切片稍甩干后，用组化笔在组织周围画圈。

2. 封闭

使用封闭液（如山羊血清）将样本完全覆盖，并置于适宜温度恒温恒湿培养箱孵育适宜时间（切片需置于湿盒内，细胞可直接置于密封好的孔板中）。

3. 免疫染色

i）一抗稀释孵育：按照说明书要求，将抗体稀释于抗体稀释液中；吸走封闭液，加入稀释后的一抗，4℃孵育过夜。

ii）复温洗涤：将样本置于常温复温；用TBST缓冲液洗涤适宜时间以去除抗体工作液，再用TBST缓冲液洗涤3次。

iii）二抗稀释孵育：按照说明书要求，将抗体稀释于抗体稀释液中；加入稀释后的二抗，室温避光孵育适宜时间。

4. 染核/封片

i）染色：在样本上滴加DAPI工作液，避光室温下孵育适宜时间。

ii）洗涤：用TBST缓冲液洗涤以去除DAPI工作液，再用TBS缓冲液洗涤3次。

iii）加入抗荧光衰减封片剂：细胞免疫荧光最好不封片。

5. 成像和数据收集

于荧光显微镜下观察并采集图像。

实验结果：

应用：

由于其具有特异性强、敏感性高、速度快等优点，故可广泛用于科学研究（如测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质）。随着多重免疫荧光技术的兴起和发展，在临床诊断上的应用也越来越丰富（根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等）。

参考：

[1] 知乎-免疫荧光（IF）染色及优化技巧

[2] 知乎-超全攻略 ！一文理清免疫荧光实验步骤、技巧及疑难问题

[3] 知乎-石蜡切片和冰冻切片之高质量HE染色、免疫组化、免疫荧光染色

[4] 知乎-石蜡切片免疫荧光实验报告及结果展示-上海郑核

[5] 知乎-干货分享 | 冰冻切片免疫荧光实验流程

[6] 知乎-免疫荧光染色步骤和原理

[7] 知乎-一分钟带你了解免疫荧光技术步骤及原理（IF实验）

[8] 搜狐-免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法

[9] 知乎-超详细免疫荧光染色实验流程~