IP VS Co-IP VS Pull-down 学习笔记

免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）

是指利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。

一般是利用Protein A-磁珠或Protein G-磁珠将目的蛋白X从混合物中免疫沉淀下来，最后将可溶性靶蛋白从磁珠上洗脱下来进行检测（如果抗体没有共价连接到磁珠上或使用变性缓冲液进行洗脱，抗体也会被洗脱下来）。

例如蛋白X在细胞内的蛋白量不同，或有着不同的翻译后修饰，这时就可以用X蛋白抗体+Prorein A beads来进行IP，从细胞中把蛋白X拉下，再用特异的抗体（如磷酸化，泛素化抗体）进行WB来检测蛋白X的变化。

简言之，IP就是检测单个蛋白的状态。

免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）

Co-IP是免疫沉淀的延伸，主要用于蛋白-蛋白相互作用检测。如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。如果样品溶液中存在与靶蛋白相互作用的目的蛋白，也会被一同捕获及纯化得到，随后利用SDS-PAGE，Western Blot等手段对得到的目标蛋白进行分析。

例如，当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质相互作用被保留了下来，假如细胞内存在 XY 蛋白复合物，用 X（X也称为诱饵蛋白）的抗体免疫沉淀 X，那么与X 在体内结合的蛋白质 Y（Y也称为靶蛋白）也被沉淀下来。因此在细胞裂解液中加入 X 的抗体沉淀蛋白X，随后利用蛋白印迹（western blot，WB）检测沉淀中是否存在蛋白 Y，如果存在，则说明细胞内存在XY蛋白复合物，即蛋白XY存在相互作用。（在体外验证X和Y之间有联系）

简言之，Co-IP就是检测蛋白间的相互作用。

Pull-down

基本原理是将靶蛋白固定于某种基质上（如Sepharose）作为与目的蛋白亲和的支撑物，即“诱饵蛋白”。目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(配体蛋白/目的蛋白)，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。通过Pull-down技术可以确定“诱饵蛋白”与捕获蛋白”间的相互作用或筛选相应目的蛋白。为了更有效地利用Pull-down技术，可以将待纯化的蛋白以融合蛋白的形式表达，即将“诱饵蛋白”与一种易于纯化的配体蛋白相融合。

在Pull-down中用的比较多的有GST Pull-down。当GST融合蛋白在经过固定有谷胱甘肽GSH的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说，GST Pull-down可用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。

除了GST以外，类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵蛋白”可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵蛋白”可以通过结合Ni2+ 的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵蛋白”可以通过固定有氨甲蝶呤的色谱柱进行纯化等等。

参考：

[1] 知乎-免疫沉淀（IP）的原理和应用

[2] 知乎-IP，Co-IP，GST-Pull Down傻傻分不清楚？

[3] 知乎-pull-down、ip、co-ip以及chip概念区别

[4] 知乎-免疫沉淀和Pulldown，这些方法原理你弄懂了吗？

[5] 知乎-Pulldown与免疫共沉淀（CoIP）实验

[6] 优宁维生物-免疫沉淀与分子间相互作用

[7] 金开瑞-简要区分EMSA、染色质免疫共沉淀、免疫共沉淀、免疫沉淀、pull-down实验

[8] 丁香园论坛-一篇文章，帮你搞懂免疫沉淀和免疫共沉淀的区别