AbMole科研-钙循环素结合蛋白促进果糖激酶2降解调节苹果内糖稳态

本期与您分享的是：钙循环素结合蛋白促进果糖激酶2降解调节苹果内糖稳态。

果糖激酶（FRK）通过磷酸化激活果糖，使激活的果糖进入初级代谢，调节植物的果糖信号传导能力。苹果（Malus×domestica） FRK基因MdFRK2表现出特别高的果糖亲和力，其过表达会降低幼嫩植株叶片中的果糖水平。然而，在目前对成熟植物的研究中，过度表达MdFRK2的转基因苹果树的果实比野生型（WT）果实积累了更高水平的果糖（在年轻和成熟阶段）。与WT相比，MdFRK2 mRNA高表达的转基因苹果树在成熟叶、幼果和成熟果中MdFRK2蛋白丰度和FRK酶活性均无显著差异。

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免疫沉淀-质谱分析发现skp1、cullin、F-box（SCF）E3泛素连接酶、钙循环素结合蛋白（CacyBP）与MdFRK2相互作用。RNA测序分析为泛素介导的MdFRK2蛋白转录后调控在成熟叶片和果实中维持果糖稳态提供了证据。进一步分析发现MdCacyBP-MdFRK2调控模块，MdCacyBP与MdFRK2相互作用并泛素化MdFRK2，促进其被26S蛋白酶体降解，从而降低FRK酶活性，从而提高转基因苹果树的果糖浓度。这一结果揭示了通过泛素化和降解调节MdFRK2蛋白水平来实现植物果糖在不同器官内稳态的重要机制。我们的研究为未来改进苹果风味提供了有用的数据，并扩展了我们对植物果糖含量和信号调控的分子机制的理解。

MG132（Abmole，M1902，纯度>98%）（ https://www.abmole.cn/products/mg132. html）是一种蛋白酶体抑制剂，IC50为100 nM，也抑制钙蛋白酶，IC50为1.2 μM。MG132可以抑制NLRP1的活化。

DMSO（Abmole，M3850，纯度>99%）（https://www.abmole.cn/products/dimethyl-sulfoxide.html）二甲基亚砜（简称DMSO）能溶于水、乙醇、丙醇、乙醚、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”，是常用的有机溶剂中，溶解能力最强的一种。

CacyBP同源物与siah相互作用蛋白（SIP）形成E3泛素连接酶复合物，然后以蛋白质为目标进行泛素化。这促使我们研究MdCacyBP是否可以使用体内泛素化试验来泛素化MdFRK2。在本草叶片中共表达MdCacyBP-Flag和MdFRK2- GFP，并分析MdFRK2的泛素化水平。MdFRK2-GFP蛋白的泛素化形式分别用抗Ubi和抗GFP抗体检测。当用抗泛素抗体检测时，发现分子质量较高的MdFRK2显著增加（图4A和B），说明MdFRK2的泛素化是由MdCacyBP介导的。由于泛素化修饰的蛋白质进入26S蛋白酶体进行降解，因此有理由怀疑MdCacyBP对MdFRK2的降解依赖于26S蛋白酶体途径。

为了证实这一点，我们进行了无细胞降解试验。从WT和MdFRK2-OE苹果叶片中提取的总蛋白与纯化的MdCacyBP-His在MG132或其溶剂二甲基亚砜（DMSO）存在下孵育。在指定的时间点，用抗mdfrk2抗体对蛋白质进行免疫印迹分析。如图4C和D所示，MdFRK2- OE提取物中MdFRK2蛋白的降解速度比WT提取物快，说明MdCacyBP加速了MdFRK2蛋白的降解。同时，蛋白酶体抑制剂MG132的应用抑制了MdFRK2蛋白的降解，这表明MdFRK2的降解可能是由26S蛋白酶体介导的。

MdCacyBP泛素化MdFRK2的能力是通过体内泛素化试验证实的，蛋白酶体抑制剂处理（MG132）进一步验证MdFRK2降解是否由26S蛋白酶体途径介导（图5A）。在两个OE系中，MdFRK2蛋白丰度因MG132处理而增加，但不受DMSO影响（图5B）。相比之下，在WT中，MdFRK2蛋白水平与任何一种处理相似。

这些发现证明MdFRK2蛋白通过26S蛋白酶体的方式降解。与MdFRK2蛋白丰度的增加相一致，当MG132处理时，转基因系中的FRK活性显著增加，约41%至68%（图5C）。与之形成鲜明对比的是，MG132处理后，相对果糖浓度显著低于WT（图5D）。考虑到这些分析，MdFRK2的转录后调节可能通过调节FRK活性来维持果糖稳态。

鸣谢：Jing Su, et al. Plant Physiol. 2023 Feb 12;191(2):1052-1065.