SFI1通过招募USP9X来稳定小头畸形蛋白STIL进而促进中心粒复制

写在前面

        今天推荐的是由加州大学旧金山分校生物化学和生物物理学系在2019年6月13日发表于Journal of Cell Biology（2021IF：10.539，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Jeremy F. Reiter教授，研究表明SFI1通过招募USP9X来稳定小头畸形蛋白STIL进而促进中心粒复制。

研究背景

        在哺乳动物细胞中，中心体是微管组织中心，参与细胞过程，如纤毛发生和细胞分裂。MCPH 突变会改变中心体组织并减弱中心粒重复。影响中心粒复制的人类突变会导致小头畸形。

摘要部分

        作者确定了酵母SFI1的哺乳动物同源物的作用，参与酵母纺锤体极体的复制，作为哺乳动物细胞中中心粒复制的关键调节器。哺乳动物SFI1与USP9X相互作用，USP9X是一种与人类综合征性智力低下相关的去泛素化酶。STIL是中心粒复制的关键调节因子，SFI1在 S 期将USP9X定位到中心体以去泛素化STIL。USP9X介导的去泛素化可保护STIL免于降解。与USP9X在稳定STIL中的作用一致，来自USP9X功能丧失突变患者的细胞STIL水平降低了。总之，这些结果表明SFI1是一种中心体蛋白，可将USP9X定位到中心体以稳定STIL并促进中心粒复制。作者认为USP9X对STIL的保护以促进中心粒复制是这两种蛋白质在人类神经发育中的作用的基础。

研究内容

1.SFI1在S期聚集在中心体     

        在酿酒酵母中，SFI1是纺锤体极体复制的关键调节因子，其功能相当于中心体。为了评估SFI1的人类同源物是否与中心体相关，作者生成了人类SFI1的抗体，并为SFI1和中心蛋白2共染色了 HeLa 细胞。人SFI1不存在于有丝分裂纺锤体两极，但位于间期中心体周围，在S期达到峰值。为了进一步测试SFI1的中心体富集，作者从 HeLa 细胞中分离了中心体，发现SFI1与中心体成分 γ-微管蛋白共同分离。使用GFP标记的SFI1，作者评估了转染后S期的定位。GFP-SFI1定位于间期中心体。有趣的是，在GFP-SFI1转染后12小时，细胞表现出与成熟中心粒蛋白 CP110的共定位，表明SFI1表达的增加可能促进中心粒复制。

        作者进一步研究发现SFI1在 HeLa 和 U2OS 细胞中与外围成分CEP131部分共定位。为了确认SFI1定位于中心体外围，作者探究了SFI1在 PCM1（PCM1 是中心卫星的重要组成部分，对于中心卫星的完整性至关重要）敲除或敲低细胞中的定位。在没有中心体卫星的情况下，SFI1在中心体积累，类似于其他卫星蛋白。由于中心粒复制需要中心粒及其周围成分，作者探究了两者在SFI1敲除细胞中的组织。敲除SFI1的 HeLa 细胞显示CEP135的中心体定位增加，CEP135 是中心粒组装和稳定性所需的 MCPH 相关蛋白。免疫印迹分析显示，SFI1敲低导致 CP110 水平降低，但不会导致CEP135水平降低，进一步表明SFI1参与了中心体周围基质的组织。

研究结论：SFI1在S期聚集在中心体。

2.中心粒复制需要SFI1     

        为了确定SFI1对于中心粒的复制是否必须，作者研究了SFI1的敲低是否会废除中心粒的复制。与以前的研究一致，siRNA介导的SFI1的敲低减少了中心粒的数量。作者通过连续切片电镜探究了S期对照和SFI1 siRNA处理的细胞中的中心粒。对照组细胞形成了与先前存在的中心粒相关的原中心粒，而SFI1缺失的细胞未能复制其中心粒。因此，人SFI1是中心粒复制所必需的。     

        作者接下来探究中心粒复制的早期启动因子SAS6和STIL的定位。研究发现，SFI1敲低的细胞不能招募SAS6和STIL到S期中心体。免疫印迹分析显示，SFI1的敲低并不明显影响SAS6的水平，但却大大降低了STIL的水平，这表明在SFI1敲低的细胞中，中心粒复制的失败可能是由于STIL的不稳定造成的。

        通过免疫印迹分析，作者发现SFI1的敲低破坏了全长STIL和STIL的MD3结构域的稳定性，表明SFI1通过aa 715-988稳定STIL。由于SFI1定位并稳定中心体CP110，而CP110与中心粒复制有关，作者研究了恢复CP110的稳定性是否可以回补SFI1敲低的细胞中的中心粒复制。为了恢复 CP110 的稳定性，作者敲低了 NEURL4，一种靶向 CP110 进行降解的中心体泛素连接酶。免疫印迹分析显示，NEURL4的敲低恢复了SFI1敲除细胞中的CP110水平。

研究结论：FI1的敲低破坏了STIL的稳定性。

3.SFI1与USP9X相互作用并将其招募到中心体     

        作者通过中心体蛋白的邻近相互作用物数据库检测到STIL相互作用物，确定了几种 DUB可能发生相互作用，包括USP9X和USP14。作者使用内源性STIL的免疫沉淀表明STIL与USP9X和USP14共沉淀。为了验证USP9X是否控制STIL功能，作者测试了它是否与STIL类似，参与了中心粒复制。USP9X的敲低减弱了中心粒重复、STIL的表型复制消耗，同时降低了STIL的中心体定位和蛋白质水平。为了进一步评估USP9X是否影响STIL水平，作者表达了HA-USP9X或酶促失活的 HA-USP9XC1566A。HA-USP9X的表达升高会增加STIL水平，而HA-USP9XC1566A则不会。由于USP9X是一种去泛素化酶，作者随后检查了表达 HA-USP9X的细胞中STIL的稳定性是否与STIL泛素化降低有关。HA-USP9X的表达减少了K48连接的泛素化STIL。

        为了确认USP9X定位于中心体，作者用Centrin对 HeLa 细胞进行染色以标记中心粒和USP9X。与SFI1一样，USP9X在S期定位于中心体。USP9X水平在G1和S阶段仅略高，表明其中心体定位不是由于其他阶段的选择性降解。另一方面，SFI1的敲低也阻止了USP9X在中心体上的积累。敲低USP9X并不影响SFI1的中心体定位或稳定性，表明SFI1是USP9X中心体定位所必需的，反之亦然。

研究结论：USP9X促进了STIL水平，USP9X与其相互作用因子SFI1一样，对于S期中心体的STIL积累至关重要，SFI1对USP9X定位到中心体是必不可少的，并稳定STIL以促进中心粒的复制。

4.USP9X直接去泛素化STIL    

        作者接下来USP9X的药理学抑制是否会降低STIL稳定性。作者用 WP1130处理 HeLa 细胞，WP1130（Degrasyn）是USP9X的选择性抑制剂。STIL水平被WP1130明显降低。由于中心粒复制需要STIL，作者检查了WP1130是否也影响中心粒数。STIL和 Centrin的免疫荧光染色显示WP1130减少了STIL在中心体的定位，并减少了中心粒数。这些发现表明WP1130破坏了中心体组织。USP9X与STIL相邻。相互免疫沉淀证实，USP9X和STIL相互作用。为了确定STIL的哪个结构域结合USP9X，作者通过免疫沉淀发现STIL的MD3片段与USP9X相互作用。为了测试MD3片段是否影响STIL稳定性，作者克隆了表达全长Myc标记的STIL和缺乏MD3结构域 (STILΔMD3) 的STIL的构建体。有趣的是，研究发现STILΔMD3的稳定性明显低于全长STIL。除了稳定性较差之外，STILΔMD3不结合USP9X。因此，USP9X通过其MD3域结合并稳定STIL。作者接下来研究了MD3是否被K48多泛素化。研究发现MD3域被K48多泛素化，这表面USP9X可能通过与其MD3域相互作用和去泛素化来稳定STIL。另一方面，实验发现USP9X的催化结构能特异性地使全长的STIL及其MD3结构域去泛素化。

研究结论：USP9X通过去泛素化其MD3域来稳定STIL，并且STIL稳定性对于中心粒复制至关重要。

5.神经发育USP9X突变使STIL不稳定     

        最近的一项研究确定了MRXS99F女性的USP9X功能丧失突变。MRXS99F患者表现出发育迟缓、颅面异常和先天性脑畸形。为了测试与MRXS99F相关的功能丧失突变是否影响USP9X定位，作者检查了USP9X在MRXS99F患者成纤维细胞中的定位。有趣的是，与对照相比，所有患者细胞系中USP9X的中心体积累都有所减少。同时，SFI1的定位在MRXS99F成纤维细胞中没有受到影响。与作者发现的USP9X稳定STIL相一致，MRXS99F相关的USP9X突变减少了中心体STIL。检查MRXS99F成纤维细胞的中心体组织，发现CP110减少，CEP135增加。鉴于MRXS99F成纤维细胞中中心体STIL的减少，作者评估了患者来源的成纤维细胞中的中心体数量。所有测试的四个MRXS99F成纤维细胞系都显示出中心粒的数量减少，这就提出了MRXS99F相关的智力障碍和大脑畸形是由于神经发生过程中中心粒复制的缺陷而产生的可能性。

        由于USP9X也控制STIL的稳定性，而STIL促进中心粒的复制，作者研究了MRXS99F成纤维细胞中中心粒的数量减少是否与STIL的不稳定有关。分析发现所有四个MRXS99F成纤维细胞系都显示出STIL水平的降低。与SFI1在USP9X上游的功能一致，SFI1的蛋白水平没有改变。作者提出，MRXS99F可能至少是由STIL稳定性下降和中心粒复制的伴随性缺陷引起的。

研究结论：哺乳动物SFI1是一种中心体蛋白，它控制去泛素化酶USP9X的定位以稳定STIL，从而积极地调节中心粒的复制，USP9X介导的对STIL水平和中心粒复制的控制对于人类大脑发育至关重要。

结论与讨论

        总之，作者发现人类SFI1在S期定位于中心体并招募USP9X，在那里它们起到稳定原中心粒因子STIL的作用，最终促进中心粒复制。这些发现为中心粒复制的时间如何被调控，以及损害大脑发育的人类突变如何破坏中心粒的生物发生提供了机制上的见解。

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原文链接：https://doi.org/10.1083/jcb.201803041