免疫学必学实验：免疫组化（IHC）

免疫学必备三件套：蛋白质免疫印迹（WB）、免疫组化（IHC）、酶联免疫吸附试验（ELISA），分别应用于定性、定位和定量。

其中免疫组化实验，广泛应用于基础研究和临床病理诊断，在基础研究中可用于确定细胞内抗原，并对其进行定位、定性及定量的分析，在临床病理诊断方面，可用于判断肿瘤的来源、分类和鉴别诊断及评估临床治疗。

今天梳理下免疫组化（IHC）实验的分类、实验操作，以及应用实例的一些重点内容。萌新打好基础，老手巩固知识！

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一、免疫组化原理

1.免疫组织化学技术 / IHC

IHC是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）。通过带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞与对应组织结合化学反应显色，对其进行定位、定性及定量的研究。

2.免疫组化分类

• 酶---免疫酶组织化

• 荧光素---免疫荧光组化

• 胶体金---免疫胶体金组化

• 高亲和力物质---亲和免疫组化

①免疫酶组化

以酶标记的抗体与组织作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物，通过光镜对细胞表面和细胞内的抗原进行定位定量。

特点：信号定位准确 ，标本可长期保存，易于检测阳性标记与病变关系，方法简便，易推广，是目前最常用的技术。

②免疫荧光组化

用荧光素标记的抗体检查组织内相应抗原。抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射即会发出特定波长的荧光，在荧光显微镜下可对抗原定位或定量。

特点：特异性强、灵敏度高、快速简便，应用较广。

③免疫胶体金技术

1）用胶体金标记的抗体作为探针，对抗原进行定性、定位，或定量研究。

2）胶体金是指金的水溶胶，能迅速而稳定地吸附抗体而不影响抗体活性。

特点：胶体金有不同大小的颗粒，且电子密度高，所以特别适合于电镜的定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。

④亲和免疫组化

利用两种物质间高度亲和特性及可标记性，将酶等标记物连接到亲和物上，以对待检物进行检测。

特点：灵敏度高，有利于微量抗原在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。

二、免疫组化实验步骤

1.免疫酶组化步骤

1）标本制备

2）免疫染色

3）数据获得（观察）

三、免疫组化实例

1.IHC实例I-单染

IHC抗MISIIR抗体对异种移植肿瘤切片染色，DAB显色，根据密度评分以评价表达量。

2. IHC实例II-单染细胞定位

兔肝脏石蜡切片。Ki67 （棕色）及HE复染。圆圈指示阳性细胞，箭头指示淋巴细胞。

3.IHC实例 III-双染指示位置关系

S-100 神经特异性蛋白 红色; AE1/3 鳞状细胞标志物，棕色

鳞状细胞（棕色）包绕神经束膜内（红色）,部分侵入束膜

4.IHC实例 IV-双染指示特定细胞表达

免疫组化双染标记大鼠结肠石蜡切片。指示巨噬细胞内iNOS表达。

1）CD68-巨噬细胞标志物

2）iNOS-诱导性NOS

5.IHC实例 V-三染

①Shh-细胞损伤标志物

②K8/18及Ub指示细胞膨胀

③SMA-成肌纤维细胞标志物

④Sox-9-前体细胞标志物

⑤Gli-2-Hh通路活化标志物

1）K8/K18（棕色）和Ub（紫红色）双阳性肝细胞

2）α-SMA （棕色）, gli-2（红色）和sox-9 （蓝色）三阳性细胞

6.IHC实例 VI-荧光三染

①SMA-647 纤维细胞标志物

②Catenin –568 钙黏蛋白

③Actin-FITC 细胞骨架

④DAPI-细胞核

小鼠肠组织切片，免疫荧光三染

老实说，免疫组化确实是个苦活，耗费时间长，步骤多，还要经常接触有毒致癌物质。想染出了漂亮的片子和实验结果就必须要有正确的实验思路和操作方法。

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