如何从总核糖核酸中分离出

什么是mRNA

mRNA是蛋白质编码基因的转录本。它是在真核生物的细胞核内产生的，并将特定蛋白质的产生信息带入细胞质中。在核糖体的帮助下，它在翻译过程中被翻译成蛋白质的氨基酸序列。真核生物转录产生的主要转录本称为前mRNA。

图1：mRNA结构

在转录后修饰期间，产生具有几个特征的成熟mRNA分子，例如5′帽和聚（A）尾。特定生物体的总mRNA被称为其转录组。

总RNA的组成是什么

RNA 分离的结果称为总 RNA。它由细胞产生的所有三种主要类型的RNA组成。它们是磁共振、叔丁酸和右旋核酸。叔丁酸和右旋核酸都有助于翻译。真核生物mRNA的大小为0.5-20 kb。转移核糖核酸（tRNA）在翻译过程中带来相应的氨基酸。它长76-90个碱基对，由抗密码子区域组成，与mRNA上的特定密码子互补。核糖体核糖核酸（rRNA）是核糖体的一种成分。一些人类 rRNA 的长度为 5 kb。

超过90%的总RNA由tRNA和rRNA组成。只有总RNA的1-5%是磁共振。典型的哺乳动物细胞可能由每个细胞约500，000个mRNA分子组成。特定类型的mRNA的量可以是每个细胞15-20，000个拷贝。

如何从总RNA中分离出mRNA

根据细胞类型从总RNA中分离mRNA有两种主要方法：直接分离mRNA的方法和减去mRNA分离的方法。

直接分离

图2：亲和色谱

总RNA应溶解在高盐缓冲液中，并短暂加热至65-70°C以破坏RNA的二级结构。RNA分离的条件在市售的mRNA分离试剂盒中有所不同。然而，聚（A）-RNA或mRNA的制备由三个步骤组成。

1. 聚（A）-RNA与连接到载体的寡核苷酸dT分子的杂交

2. 洗去未结合的核糖核酸

3. 在低严格条件下从寡核苷酸-dT/载体组合中洗脱聚（A）-RNA

减去分离多核糖核酸的方法

基于寡核苷酸 dT 的 mRNA 纯化仅产生具有多（A） 尾部或成熟真核 mRNA 的 mRNA。因此，另一种称为减法的方法可用于纯化没有聚（A）尾的mRNA。该方法可用于从酵母和细菌总RNA中分离mRNA。它也可用于从真核细胞中分离未成熟类型的mRNA以及成熟的mRNA。

1. 总RNA与rRNA序列特异性、5′生物素标记寡核苷酸探针杂交

2. 去除 rRNA/5′-生物素标记的探针复合物以及链霉亲和素包被的磁珠

3. 杂质的纯化和mRNA的洗脱。