doi: 10.3389/fonc.2022.654449

摘要：肝细胞癌（HCC）是最常见和最致命的肝癌类型。自噬是将受损或老化的细胞成分转运到溶酶体中进行消化和降解的过程。越来越多的证据表明自噬是肿瘤进展的关键因素。本研究的目的是确定一组新的肝癌自噬相关预后标志物。

实验方法：

人体组织

从在温州医科大学第一附属医院（中国温州）接受手术切除的患者中获得了 20 对肝癌和匹配的正常邻近组织样本。本研究中分析的所有样本的临床病理学特征均确认为肝细胞癌。所有标本均在液氮中冷冻。伦理批准由医院伦理委员会确认，并获得每位患者的书面知情同意。

定量实时 PCR

使用 TRIzol 试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从组织中分离总 RNA。使用 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (RR036A, Takara Bio, San Jose, CA, USA) 进行逆转录。使用 SYBR™ Green PCR Master Mix (RR036A, TAKARA Bio, USA) 使用 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 进行 PCR。表 S3列出了本研究中使用的引物。

细胞系和培养

人肝星状细胞系LX2、正常肝细胞系L02和HCC细胞系MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3、Hep3B、PLC/PRF/5和Huh7获自中国科学院细胞库。将细胞在补充有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 RPMI 1640 或 DMEM 中在 37°C 和 5% CO 2下培养。

细胞转染

根据制造商的方案，使用 Lipofectamine 3000 (L3000008; Invitrogen) 用 FKBP1A 敲低质粒转染细胞。对数生长的细胞接种于 6 孔板中，待细胞融合至 70%~80% 时进行转染。在 37°C 孵育 48 小时后，评估 FKBP1A 表达。

细胞计数 Kit-8 检测

转染48小时后，将每组MHCC97H细胞以5000个细胞/孔的密度接种到96孔板中。每组设5个重复。使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒（CK04，Dojindo，Kumamoto，Japan），并在培养0、24、48和72小时后检测吸光度值。

菌落形成试验

将处于对数生长期的转染 MHCC97H 细胞以每孔 500-1,000 个细胞的密度接种在六孔板中。当单个细胞长成肉眼可见的菌落时，用 0.1% 结晶紫（Meilunbio，大连，中国）对细胞进行染色。使用倒置显微镜计数克隆数。

Transwell 检测

使用 transwell 测定法确定细胞的迁移和侵袭能力。转染 48 小时后，将 MHCC97H 细胞 (2 × 10 4 ) 接种在涂有或未涂有 50 μl Matrigel (BD) 的 8 μm 孔聚碳酸酯膜（Corning Costar Corp, Corning, NY, USA）的上室中Biosciences, San Jose, CA, USA)。将含有 10% FBS 的 DMEM 作为化学引诱剂添加到下室。37℃孵育24 h迁移，48 h侵袭后，轻轻去除滤膜上表面的细胞，迁移至膜底部的细胞用4%多聚甲醛固定，结晶紫溶液，200 倍显微镜下计数。对五个随机视野中计数的细胞数进行平均。

伤口愈合试验

将 HCC 细胞接种在六孔板中，并在含有 1% 胎牛血清的培养基中培养。用 100 µl 移液器吸头刮擦细胞单层。然后使用显微镜（TS100-F，尼康，东京，日本）在受伤后 0、24、48 和 72 小时观察伤口愈合情况并拍照。

动物异种移植模型

BALB/C裸鼠（18-20g）购自温州医科大学，动物实验符合《动物实验机构伦理准则》。通过将用sh-FKBP1A或sh-NC转染的MHCC97H细胞(1 × 10 6 /0.1 ml)皮下植入小鼠的右侧进行异种移植。14天后，每2天检查一次肿瘤生长情况，用公式V = 1/2（宽2×长）计算肿瘤体积。最后，将小鼠安乐死，并测量肿瘤组织的重量。

蛋白质印迹分析

在 PMSF (Beyotime) 和 PhosSTOP (ROChe, Basel, Switzerland) 存在下，在 RIPA 缓冲液（Beyotime，Shanghai，China）中裂解总蛋白。根据标准程序进行蛋白质印迹。针对 ATG5、ATG7 和 Beclin-1 的抗体购自 Abcam (Cambridge, UK)。针对 SQSTM1/p62 的抗体获自 Proteintech (Rosemont, IL 60018, USA)。针对 LC3B、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 和 GAPDH 的抗体获自 Cell Signaling Technology (CST, Danvers, MA, USA)。

免疫组化染色

按照标准方案对小鼠肿瘤组织的石蜡包埋切片进行免疫组织化学染色 (IHC)。使用了针对 Ki67 (Abcam) 和 LC3B (CST) 的抗体。代表性图像由 Leica DM4000B 显微镜（德国耶拿）捕获。

统计分析

使用 X-tile 3.6.1 软件基于最小 p 值确定风险评分的截止点。使用 R 软件进行统计分析。构建受试者工作特征 (ROC) 曲线以估计风险评分的预后价值。等于或大于 0.7 的曲线下面积 (AUC) 值被视为显着的预测值。

实验数据表示为平均值±标准偏差 (SD)。所有统计分析均使用 GraphPad 8 软件进行。双边Student's t检验和ANOVA用于统计分析。p 值小于 0.05 被认为具有统计学意义。

结果

差异表达 ARGs 的鉴定

提取肝癌患者的 232 个 ARGs 的表达水平后，分别在 TCGA 和 ICGC 数据库中鉴定出 32 个和 64 个差异表达的 ARGs。图1）。此外，使用散点图可视化了这两个数据库中 HCC 组织和正常组织之间差异表达的 ARGs 的表达模式。图 2A、B）。构建了一个维恩图来识别 TCGA 和 ICGC 数据库中差异表达的 ARGs（图 2C）。最后，我们在两个数据集中揭示了 22 个常见的差异表达 ARG，包括 3 个上调基因（DIRAS3、FOS 和 ITGA3）和 19 个下调基因（ATIC、BAK1、BAX、BIRC5、CANX、CAPN1、CAPNS1、CCL2、FKBP1A、 HSP90AB1、ITGA6、MAPK3、NAMPT、PARP1、PEA15、PRKCD、RPTOR、SPHK1 和 VAMP7）。

图1

两个数据库中肝癌和正常肝组织之间自噬相关基因（ARGs）的差异表达。(A)火山图和(B) TCGA 数据库差异表达 ARG 的聚类分析。(C) ICGC 数据库差异表达 ARGs的火山图和(D)聚类分析。每个点代表一个基因。红点代表显着上调的 ARG，蓝点代表显着下调的 ARG。每列代表一个样本，每一行代表一个基因。

差异表达 ARGs 的功能富集评估

使用 GO 和 KEGG 通路分析对这些差异表达的 ARG 进行功能富集分析，阐明了其生物学功能。图 4,5）。最丰富的 GO 注释与肽基丝氨酸修饰、蛋白质结合的调节和生物过程中的结合调节有关。细胞成分包括伪足、孔复合物和整合素复合物。术语 BH 域结合、SMAD 结合和伴侣结合是确定的前三个分子功能。丰富的 KEGG 通路与细胞凋亡、结直肠癌、志贺氏菌病、铂类药物耐药性、内质网中的蛋白质加工和其他通路显着相关。大多数富集途径的 Z 分数都小于零，表明它们中的大多数会降低。对于差异表达的 ARG，包括 IL-17 信号通路和 AGE-RAGE 信号通路在内的 KEGG 通路显示在热图中。

图 5

京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 差异表达自噬相关基因 (ARGs) 通路富集分析。(A)圆圈显示分配基因的 logFC 的每个术语的散点图。红色圆圈代表上调，蓝色圆圈代表下调。(B) ARGs 和通路之间关系的热图。每个块的颜色取决于 logFC 的值。

预后性 ARG 的鉴定

我们使用单变量 Cox 回归分析评估了从 TCGA 获得的数据，以揭示患者预后与差异 ARG 表达谱之间的关系。14 个 ARGs 同时与肝癌患者的预后显着相关（图 6A）。然后，随后进行了多变量 Cox 回归分析（图 6B）。最后，ATIC、BIRC5、BAX、CAPNS1 和 FKBP1A 这五个基因被确定为 OS 的风险基因，并用于开发预后特征。此外，进行 Kaplan-Meier 分析以关注每个 ARG 的预后能力。TCGA 数据库结果表明，ATIC、BIRC5、BAX、CAPNS1 和 FKBP1A 的过表达与肝癌患者的较差 OS 密切相关。图 6C）。桑树图谱结果显示，FOXM1、H2AFX、LMNB1、POU5F1、TAT转录因子与5个基因相关（图 6D）。此外，它们都调节 FKBP1A 的表达。我们随后进行了预后分析。结果表明，转录因子 POU5F1 的高表达提示预后不良。图 6E）。

预后风险模型的建立和定义

基于OS的预后风险评分公式构建如下：风险评分=（0.5554×ATIC表达水平）+（-0.3096×BAX表达水平）+（0.2345×BIRC5表达水平）+（-0.3780×CAPNS1表达水平） +（0.5091 × FKBP1A 表达水平）。随后，进行 X-tile 分析并确定 1.9 为 TCGA 集合中风险评分的最佳截止点（图 7A-C）。使用根据 TCGA 队列中每位患者的风险评分计算的截止点，我们将他们分为两组：高风险组和低风险组。TCGA数据集中患者的风险评分分布和生存状态显示在图 7D. 接下来，热图显示了五种风险 ARG 的表达谱（图 7E）。我们观察到高危患者表现出较高的风险基因（ATIC、BIRC5、BAX、CAPNS1 和 FKBP1A）表达水平。从 ICGC 数据集获得的结果相似（图 7F，G）。

预后风险模型是肝癌的独立预测因子

使用单变量和多变量 Cox 回归模型来比较临床参数和自噬相关风险评分模型的独立预测值。在 TCGA 数据集中，单变量 Cox 分析显示风险评分、肿瘤分期以及 T 和 M 分期与 HCC 患者的 OS 相关。图 8A）。在多变量 Cox 回归分析中，五基因风险评分与生存率显着相关，而其他因素不显着。图 8B）。单变量和多变量 Cox 回归分析均显示，肝癌患者的风险特征、性别和肿瘤分期与 ICGC 数据集中的 OS 显着相关。图 8E、F）。这些结果证实，自噬相关预后模型独立预测肝癌患者的生存。

TCGA集中每位患者的风险评分采用五基因风险评分公式计算。正如预期的那样，风险评分根据最佳截止点将肝癌患者分为高危组和低危组，这些组的预后存在显着差异。图 8C）。高危患者的 OS 比低危患者短。ICGC 数据集被视为独立的外部验证集，并使用相同的方法进行处理。Kaplan-Meier 分析再次证实了该特征的预后能力（图 8G）。

使用基于 OS 的 ROC 曲线评估风险评分的预测性能。TCGA数据集中OS风险评分的AUC值为0.746，明显高于年龄（AUC = 0.524）、性别（AUC = 0.504）、肿瘤分级（AUC = 0.501）、肿瘤分期（AUC = 0.678） )、T 期 (AUC = 0.679)、M 期 (AUC = 0.508) 和 N 期 (AUC = 0.508) (图 8D）。ICGC数据集中签名的AUC也高达0.744（图 8H）。基于这些数据，风险评分可有效预测肝癌患者的生存率。

FKBP1A在体外和体内影响肝癌细胞的生物学行为

使用定量实时 PCR (qRT-PCR) 对来自相应 HCC 患者的 20 个肿瘤样本和 20 个正常邻近组织样本进行了检测。FKBP1A 和 CAPNS1 在肿瘤中的表达水平高于正常组织，但在 ATIC、BAX 和 BIRC5 的表达上没有观察到显着差异。图 9A和图 S1 )。CPTAC数据库用于分析肝癌患者FKBP1A蛋白的表达。在匹配的样本中，FKBP1A 在肝脏肿瘤中的表达水平高于在邻近组织中的表达（图 S2）。此外，使用 qRT-PCR 将 FKBP1A 在六种 HCC 细胞系（MHCC97H、MHCC97L、HuH7、LM3、Hep3B 和 PLC）中的表达水平与人肝星状细胞系 LX2 和正常人肝 LO2 细胞系中的表达水平进行了比较。 . 与 LX2 和 L02 细胞系相比，MHCC97H 细胞系中 FKBP1A 的表达显着增加（ 图 9B）。对于随后的研究，我们选择了转染 shRNA 的 MHCC97H 细胞系进行 FKBP1A 基因敲低实验。选择shFKBP1A-3组是因为质粒转染效率大于70%（图 9C）。我们进行了增殖、迁移和侵袭实验，以评估 FKBP1A 在 HCC 细胞中的生物学功能。CCK-8 测定用于评估活力和细胞增殖，并显示 FKBP1A 敲低显着损害 MHCC97H 细胞生长。图 9D）。一致地，集落形成试验的结果表明，在 FKBP1A 下调后，细胞克隆的数量减少并且克隆形成的存活受到抑制。图 9E）。进行 Transwell 测定以研究 FKBP1A 对侵袭和迁移的影响，这在癌症进展中起重要作用。与 sh-NC 组相比，FKBP1A 表达的敲低阻碍了 HCC 细胞迁移和侵袭。图 9F）。此外，还使用伤口愈合试验评估了 sh-NC 和 sh-FKBP1A 组中 MHCC97H 细胞的迁移。FKBP1A 敲低显着降低了细胞迁移的能力（图 9G）。此外，我们检测了 sh-FKBP1A在体内MHCC97H 细胞肿瘤生长中的作用。正如预期的那样，sh-FKBP1A 组的肿瘤大小、肿瘤体积和肿瘤重量显着减弱。图 9H-J）。因此，sh-FKBP1A在体内和体外正向调节恶性肿瘤的行为。

FKBP1A 敲低增加 HCC 细胞和组织中的自噬水平

我们研究了 MHCC97H 细胞中 LC3B、p62、Beclin-1、ATG5 和 ATG7 的水平，以进一步发现 FKBP1A 表达降低诱导自噬的分子机制。蛋白质印迹结果显示，FKBP1A 敲低显着增加了自噬标志物 LC3B-II、Beclin-1、ATG5 和 ATG7 的水平，并降低了 SQSTM1/p62 的水平。图 10A）。然后，用自噬抑制剂氯喹预处理MHCC97H细胞，并使用Western印迹分析上述相关蛋白。如图所示图 10B, 氯喹逆转了 sh-FKBP1A 诱导的 LC3B-II/LC3B-I 比率和 Beclin-1、ATG5 和 ATG7 水平的增加。用 sh-FKBP1A 处理后 p62 水平降低，氯喹也可逆转。PI3K/AKT/mTOR 通路与自噬关系最为密切。我们评估了用或不用 sh-FKBP1A 转染的 HCC 细胞中磷酸化 PI3K、AKT 和 mTOR 的水平，以确定 FKBP1A 介导的自噬调节是否可能涉及该信号通路。我们的蛋白质印迹结果显示转染 sh-FKBP1A 的 MHCC97H 细胞中 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 和 p-mTOR/mTOR 水平降低（图 10C）。对转染 sh-FKBP1A 的细胞施用氯喹，以进一步探索 PI3K/AKT/mTOR 通路参与 FKBP1A 介导的自噬。转染 sh-FKBP1A 的细胞中 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 和 p-mTOR/mTOR 的比率持续降低，而氯喹联合处理则增加了这些比率。图 10D)，表明 FKBP1A 诱导的 HCC 细胞自噬可能或至少部分由 PI3K/AKT/mTOR 通路介导。此外，使用 IHC 评估小鼠 HCC 肿瘤中 Ki-67 和 LC3B 的表达。我们发现 sh-FKBP1A 抑制 Ki-67 的表达并增加 LC3B 的表达（图 10E）。此外，HPA 数据库用于分析 FKBP1A 的免疫组织化学染色。FKBP1A 在肝癌中的表达水平高于在正常肝组织中的表达（图 10F）。总之，FKBP1A 敲低可能会阻止细胞增殖，但通过调节 PI3K/AKT/mTOR 信号通路诱导自噬。

讨论

HCC是最致命的人类癌症之一。随着肝癌临床管理策略的发展，一些预后因素，包括肿瘤体积、分级、分期和病灶数量，已经得到了表征（7、8）。然而，仍然迫切需要一种用于监测HCC预后的有效分子生物标志物。基于不断积累的新证据，自噬与肿瘤的发生和发展密切相关（9）。自噬机制的探索为肝癌的治疗提供了新的前景。目前，高通量生物技术已广泛应用于癌症的早期诊断。因此，使用大规模数据库将有助于探索 ARGs 的表达模式并揭示 HCC 患者的预后。

在目前的研究中，基于来自两个数据集（TCGC 和 ICGC）的高通量表达数据，我们旨在筛选与 HCC 患者预后密切相关的关键 ARG。首先，22个ARGs在肝肿瘤和正常组织之间有差异表达，包括3个上调基因和19个下调基因。GO term 和 KEGG 通路分析结果显示肿瘤生物学过程和分子功能显着富集。GO富集分析结果表明，22个差异表达的ARGs与吞噬作用和细胞粘附有关。巨噬细胞的吞噬作用在 HCC 的发生发展中起重要作用。吞噬作用的抑制与 HCC 生长和转移的风险增加有关，并且与 HCC 患者的总生存期缩短和无复发生存期相关。已经表明，转移增加与 HCC 患者的不良预后有关。细胞粘附系统的改变在肝外复发中起着核心作用。4）。在几种类型的癌症中鉴定了富集差异表达的 ARG 的 KEGG 途径。因此，特定的自噬模式可能在肝癌的发生和进展中发挥作用。然后，我们在单变量生存分析中通过降维观察了 TCGA 数据库中与 OS 相关的 14 个风险 ARG。随后的多变量生存分析确定了五个关键的预后 ARG（ATIC、BAX、BIRC5、CAPNS1 和 FKBP1A），用于构建预后风险模型，为恶性肝肿瘤患者提供准确的预后。鉴定了与这五个基因密切相关的转录因子，结果表明转录因子 POU5F1 可用于预测 HCC 患者的预后。预后风险模型和临床参数的多因素Cox回归分析表明，五基因风险评分有利于独立预测肝癌患者的预后。同时，ROC曲线分析结果表明，预后风险模型准确地区分健康人和肝癌患者。

ATIC 是一种双功能蛋白酶，催化嘌呤从头生物合成途径的最后两个步骤。根据最近的研究，ATIC 在肺癌中的表达水平很高，并且与患者预后不良有关 ( 10 )。很少有报道描述其在肝癌中的作用。HCC 中 ATIC 的上调与较短的生存期相关，并通过调节 AMPK-mTOR-S6 K1 特征来支持 HCC 细胞的增殖 ( 11 )。

BAX 已被证明是参与自噬的最广泛表征的蛋白质之一。它是 BCL2 蛋白家族的成员，通过与 BCL2 形成异二聚体而发挥凋亡激活剂的作用。Bax 参与线粒体启动的内在凋亡信号传导和由跨膜死亡受体触发的外在凋亡途径 ( 12 , 13 )。此外，BAX 影响内质网 (ER) 信号通路和线粒体通路之间的串扰 ( 14）。考虑到 Bax 在细胞凋亡中的重要作用，发现 Bax 调节多种抗癌药物诱导癌细胞凋亡的功效并不令人惊讶。SKA3 是纺锤体和动粒相关复合物的一种成分，通过调节 HCC 细胞中的 BAX/BCL-2 表达来影响细胞凋亡 ( 15 )。MT1G（一种对锌离子具有高亲和力的低分子量蛋白质）对 p53 表达的调节导致 Bax 的上调，从而导致 HCC 细胞凋亡 ( 16 )。

BIRC5 是凋亡抑制剂 (IAP) 家族的成员，可防止凋亡细胞死亡。BIRC5 通过促进增殖对 HCC 细胞发挥作用 ( 17 )。近期研究表明，BIRC5应被视为HCC分子诊断和治疗干预的潜在生物标志物，对HCC患者的预后有显着影响( 18 , 19 )。

CAPNS1 是钙蛋白酶小亚基家族的成员，作为异二聚体发挥作用，对钙蛋白酶的活性和功能至关重要。多项研究表明，CAPNS1 在肿瘤发生中具有生物学功能。事实上，已经在多种癌症中检测到 CAPNS1 表达，包括肝细胞癌 ( 20 )、卵巢癌 ( 21 )、结肠直肠癌 ( 22 ) 和鼻咽癌 ( 23 )。体外实验表明，CAPNS1 通过激活 FAK-Src 信号通路和 MMP2 促进 HCC 的生长和转移 ( 24 )。

FKBP1A 是一种顺反式脯氨酰异构酶，可与 FK506 和雷帕霉素结合并抑制钙调神经磷酸酶和 mTOR 活性 ( 25 )。FKBP1A 被证实在 HCC 中过表达并预测预后不良 ( 26 )。然而，FKBP1A 在 HCC 中的具体机制仍不清楚，值得进一步研究。

目前，FKBP1A在HCC中的具体分子机制仍未被广泛了解。使用 TCGA 和 ICGC 数据库，我们筛选了 5 个差异表达的 ARG，包括 FKBP1A，并建立了肝癌的预后模型。FKBP1A 在 HCC 组织中高水平表达，导致预后不良。相关转录因子分析表明，POU5F1可能调节CAPNS1和FKBP1A的表达，POU5F1的高表达与HCC患者预后不良有关。POU5F1 是一种干性相关转录因子，被发现可促进肝癌干细胞表型和癌症转移，并调节 HBV 衍生 HCC 的特征基因的表达 ( 27 , 28 )）。对 CPTAC 数据库中数据的分析表明，FKBP1A 在 HBV 相关的 HCC 中也有差异表达。该研究的主要发现是，FKBP1A 的表达不仅在公共数据库中而且在我们收集的 HCC 组织中都显着上调，表明 FKBP1A 可能是一个潜在的诊断标志物。一致地，FKBP1A 在 HCC 细胞系中过表达，表明 FKBP1A 可能在 HCC 发展中作为癌基因发挥作用。体外细胞功能测定证实，FKBP1A 敲低显着改变了肝癌细胞的生物学行为，其下调降低了细胞增殖、迁移和侵袭。此外，FKBP1A 的缺失显着抑制了裸鼠异种移植模型中 HCC 细胞肿瘤的生长。我们的数据还显示，FKBP1A 的低表达通过PI3K/AKT/mTOR 通路在体外和体内诱导自噬。

综上所述，自噬与肝癌患者的预后密切相关。如本研究所示，风险 ARGs 是 HCC 潜在的候选预后生物标志物，在指导有关临床治疗选择的决策中具有价值。同时，我们验证了 FKBP1A 的临床和功能意义，但需要进一步研究以阐明更详细的机制。然而，我们研究的主要限制是我们使用了来自两个公共数据库的可用数据，上述结果需要在前瞻性研究中进一步调查。