去泛素化酶USP20通过稳定p62调节TNFα诱导的NF-κB信号通路

写在前面

        今天推荐的是由韩国成均馆大学生物科学系在2020年4月28日发表于International Journal of Molecular Sciences（2020IF：5.923，JCRQ1/Q2）的一篇文章，通讯作者是Seok Hee Park教授，研究表明去泛素化酶USP20通过稳定p62调节TNFα诱导的NF-κB信号通路。

研究背景

        p62/sequestosome-1是一种支架蛋白，参与多种细胞过程，如自噬、氧化应激、细胞存活和死亡。已确定它与非典型蛋白激酶Cs(aPKCζs)相互作用，并将这些激酶与肿瘤坏死因子(TNFα)的NF-κB激活联系起来。p62的多种功能是通过p62内几个结构域的翻译后修饰来调节的。在介导这些翻译后修饰的酶中，与参与p62泛素化的E3连接酶相比，人们对从p62中去除泛素链的去泛素化酶(DUB)知之甚少。

摘要部分

        在这项研究中，作者首先证明了泛素特异性蛋白酶USP20在调节TNFα介导的NF-κB活化中p62稳定性中的作用。USP20与p62特异性结合，并作为TNFα通过去泛素化赖氨酸48(K48)连接的多泛素化激活NF-κB的正调节剂，最终促进细胞存活。此外，USP20的敲低会破坏TNFα介导的NF-κB激活所需的非典型PKCζ-RIPK1-p62复合物的形成，并显着增加由TNFα加放线菌酮或TNFα加TAK1抑制剂诱导的细胞凋亡。这些发现有力地表明，USP20-p62轴在由TNFα非典型PKCζ信号通路诱导的NF-κB介导的细胞存活中起重要作用。

研究内容

1.USP20稳定p62蛋白     

        以前，作者发现在泛素特异性蛋白酶20(USP20)敲低的HeLa细胞中，p62自噬衔接蛋白的表达显示基础水平略有下降，这表明USP20直接调节p62表达。为了验证这种可能性，作者检测了USP20敲低的HeLa细胞中p62 mRNA或蛋白质的表达。USP20敲低不影响p62 mRNA的水平，但显着降低了p62蛋白的表达。免疫荧光分析还表明，HeLa细胞中USP20的敲低显着降低了内源性p62蛋白的表达。此外，HEK293细胞中USP20的以剂量依赖性增加了p62的表达。这些结果表明去泛素化酶USP20参与p62蛋白稳定性的调节，而不是p62 mRNA水平的调节。

        为了进一步证实这些结果，作者在蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)存在下检查了p62蛋白的半衰期。在存在CHX的情况下，USP20在HeLa细胞中的过表达显着增加了p62蛋白的半衰期以及p62的基础水平，但USP20催化失活(CI)突变体（USP20- CI）的过表达没有。此外，与对照HeLa细胞相比，去除USP20的HeLa细胞中p62蛋白的半衰期显着缩短，并且基础水平p62的稳定性也受到影响。

研究结论：USP20稳定了p62蛋白。

2.USP20去泛素化p62K48-连接的多聚泛素化

        为了了解USP20去泛素化酶活性在调节p62稳定性中的重要性，作者首先检查了USP20是否直接去泛素化p62。将编码Flag-p62和HA-Ubi的质粒与WT USP20或USP20-CI共转染到HeLa细胞后，进行了免疫沉淀和免疫印迹分析。WT USP20显着降低了p62的多泛素化，而催化失活的突变体则没有。HeLa细胞中的Ni-NTA下拉测定也显示出类似的结果，支持USP20去除p62多泛素化。作者还探究了在蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)存在下p62蛋白的半衰期。在存在CHX的情况下，USP20在HeLa细胞中的过表达显着增加了p62蛋白的半衰期，但USP20-CI的过表达没有。此外，与对照HeLa细胞相比，去除USP20的HeLa细胞中p62蛋白的半衰期显着缩短，基础水平p62的稳定性也受到影响。因此，这些结果表明USP20稳定了p62蛋白。接下来，作者研究了USP20去泛素化p62的哪种多泛素化模式。作者发现p62的K48连接的多泛素化被USP20显着去泛素化，但K63连接的多泛素化不受影响。

研究结论：USP20通过去泛素化K48连接的多泛素化链来调节p62的稳定性。

3.USP20是TNFα通过直接结合p62诱导NF-κB激活所必需的

        作者发现USP20可以稳定p62蛋白，这促使作者检查USP20是否直接与p62结合。当编码HA-USP20和Flag-p62的质粒在HeLa细胞中异位表达时，共免疫沉淀分析揭示了USP20与p62的直接相互作用。作者接下来检查了TNFα处理后USP20与p62的内源性相互作用。免疫沉淀分析支持在HeLa细胞中接受TNFα处理后USP20和p62之间的内源性相互作用。这些结果使作者研究了USP20是否是TNFα诱导的NF-κB激活所必需的。USP20的异位表达增强了TNFα处理后NF-κB介导的报告基因活性，并增加了p62的表达。此外，实时定量RT-PCR分析显示，在TNFα处理后，USP20敲低降低了NF-κB介导的靶基因的表达，这些基因与细胞存活相关。此外，在TNFα存在下，USP20敲低显着降低了IKK/磷酸化并延迟了IB降解。

        因为作者的研究结果表明USP20是通过靶向p62激活TNFα介导的NF-κB所必需的，作者接下来检查了内源性p62蛋白的去泛素化是否受USP20调节。与对照细胞相比，在TNFα处理后，USP20敲低的HeLa细胞在5分钟时未观察到多泛素化p62的减少，但内源性p62的多泛素化模式增加，证明USP20是在TNFα介导的NF-κB激活中稳定p62的正调节剂。通过与p62的相互作用，USP20可能是包括p62、PKCζ和RIPK1在内的信号复合物的组成部分，用于TNFα诱导的NF-κB激活。为了验证这种可能性，作者研究了USP20敲低是否会在TNFα处理后破坏由p62、PKCζ和RIPK1组成的信号复合物的形成。免疫沉淀分析显示，PKCζ介导的信号复合物在USP20敲低的细胞中被破坏，表明USP20是TNFα中的关键成分-通过去泛素化和稳定p62蛋白诱导NF-κB活化。

研究结论：USP20是TNFα通过直接结合p62诱导NF-κB激活所必需的。

4.USP20敲低增加细胞凋亡

        作者的结果表明USP20-p62轴负责PKCζ介导的NF-κB激活以促进细胞存活，因此USP20敲低可能会促进细胞死亡。为了验证这种可能性，作者在TNFα加放线菌酮(CHX)存在下检查了USP20敲低和对照HeLa细胞的细胞活力。使用TNFα/CHX的原因是因为哺乳动物细胞对TNFα的反应可以通过与CHX共同处理转换为细胞凋亡。与表达siCON的对照细胞相比，在TNFα/CHX存在下，HeLa细胞中USP20的敲低显着降低了细胞活力和细胞数量。在相同条件下，在p62敲低的HeLa细胞中也观察到USP20敲低后的这种凋亡效应。此外，与对照HeLa细胞相比，在TNFα/CHX存在下，USP20敲低增加了裂解的caspase-8、caspase-3和PARP的表达，并导致这些裂解蛋白的基础水平增加。FACS分析也显示UPS20敲低导致NF-κB介导的RIPK1非依赖性细胞凋亡的增加。

        接下来，作者探究了USP20敲低是否与RIPK1依赖性细胞凋亡有关。当RIPK1的磷酸化被TAK1缺陷或TAK1抑制剂（5Z-7）阻断时，TNFα会促进RIPK1的激活，导致RIPK1依赖性细胞凋亡。与TNFα/CHX处理类似，在存在TNFα和5Z-7的情况下，HeLa细胞中USP20的敲低以及p62的敲低降低了细胞活力和细胞数量。免疫印迹分析地显示，在用TNFα/5Z-7处理后，USP20敲低的HeLa细胞中裂解的caspase-8、caspase-3和PARP的表达增加。这些发现清楚地表明USP20的敲低，阻断NF-κB介导的细胞存活，增加RIPK1依赖的细胞死亡。

研究结论：USP20敲低能够增加细胞凋亡。

结论与讨论

        总之，作者证明了PKCζ介导的NF-KB信号通路需要去泛素化酶USP20，通过在TNFα存在下稳定p62支架蛋白。因此, 作者的数据定义了USP20在TNFα信号通路中对p62进行翻译后修饰的新机制。

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原文链接：https://www.mdpi.com/1422-0067/21/9/3116