Mol Cancer：中南大学发现鼻咽癌细胞增殖和转移circRNA作用机制

近日，中南大学肿瘤研究所熊炜和曾朝阳教授为共同通讯作者，在 Molecular Cancer (IF: 27.401) 期刊发表了题为“Circular RNA circRNF13 inhibits proliferation and metastasis of nasopharyngeal carcinoma via SUMO2”的研究论文，报道了环状 RNA circRNF13 在鼻咽癌增殖和转移中的分子机制。

中南大学博士生莫勇真、博士后王裕民为共同第一作者。文章中全转录组测序及分析由欧易生物协助完成。

 研究背景 

鼻咽癌是一种恶性肿瘤，在东南亚和我国南方地区高发。由于其早期症状不明显，鼻咽癌极易发生侵袭和转移。深入研究鼻咽癌发病、转移的分子机制，对于鼻咽癌的防治具有重要价值。circRNA 与肿瘤的发展密切相关，但在鼻咽癌中 circRNA 研究较少。

 研究内容 

本研究在鼻咽癌细胞中鉴定到一个新的环状 RNA circRNF13，其在肿瘤组织和鼻咽癌细胞中低水平表达。体内和体外实验表明，circRNF13 可以抑制鼻咽癌的增殖和转移。从机制上讲，circRNF13 通过直接结合 SUMO2 mRNA 的 3’-UTR，延长了 SUMO2 mRNA 的半衰期。上调 SUMO2蛋白水平介导 GLUT1 的 SUMO 化和泛素化来促进 GLUT1 降解，通过抑制糖酵解调节 AMPK-mTOR 通路，最终抑制鼻咽癌的增殖和转移。本研究为进一步阐明鼻咽癌发病机制和靶向治疗提供了重要的理论基础。

 研究结果 

1. circRNF13 在鼻咽癌组织中低表达

对鼻咽癌细胞系进行全转录组测序，共鉴定到 6,153 个 circRNA。利用 RT-PCR 对表达丰度 top 20 的 circRNA 在鼻咽癌临床组织（NPC）中进行了验证，其中 circRNF13 在鼻咽癌组织中表达含量较低，但在正常鼻咽黏膜/上皮组织（NPE）中表达含量更高（图 A、B）。RT-PCR 也证实，相比于 NPE 细胞，circRNF13 同样在多个 NPC 细胞系中表达偏低。

Sanger 测序表明，circRNF13 是由 RNF13 基因 2-8 外显子反向剪接形成的环状 RNA（图 C）。进一步实验表明，circRNF13 在胞核和胞质中均有分布（图 D-E），并且经 RNase R 酶处理的 NPC 细胞中 circRNF13 比 RNF13 mRNA 更稳定（图 F）。

图 1 | CircRNF13 在鼻咽癌中低表达

2. circRNF13 在体内和体外抑制 NPC 细胞的增殖、迁移和侵袭

在 NPC 细胞中过表达 circRNF13，可以明显抑制 NPC 细胞的增殖，细胞的迁移能力、侵袭能力也下降。反之，在 NPC 细胞中下调 circRNF13，可以促进 NPC 细胞的增殖、迁移和侵袭（图 A-E）。

图 2 | circRNF13 抑制 NPC 细胞的增殖、迁移和侵袭

同样，在裸鼠皮下移植瘤和肺转移模型中，circRNF13 过表达可以抑制肿瘤大小，转移也受到明显抑制；而 circRNF13 敲低 可以促进肿瘤大小和转移。

3. circRNF13 是通过哪个途径抑制 NPC 的转移和侵袭？

为进一步研究 circRNF13 在鼻咽癌增殖和转移中的分子机制，利用 LC-MS/MS 对 circRNF13 knockdown 的 NPC 细胞进行了蛋白鉴定。结果显示，与对照组相比，共 294 个蛋白存在差异表达，其中多个差异蛋白属于糖酵解途径。生化检测结果表明，过表达 circRNF13 可以引起 NPC 细胞糖酵解能力的显著下降，而下调 circRNF13 可以显著提高细胞的糖酵解能力（图 A-B）。

之前研究表明，当糖酵解过程被抑制时，细胞内的 AMPK 水平被磷酸化激活，活化的 AMPK 通过抑制 mTOR 抑制蛋白质的合成和翻译，进而抑制肿瘤的生长和转移。WB 检测结果显示，过表达 circRNF13 的 NPC 细胞中 AMPKα 磷酸化水平显著升高、mTOR 蛋白表达显著下降，下调 circRNF13 与之结果相反（图 C），并且添加糖酵解抑制剂 2-DG 可以消除 circRNF13 对 AMPKα 磷酸化的影响（图 D）。以上结果表明 circRNF13 可能通过抑制糖酵解来抑制鼻咽癌的迁移和侵袭。

图 3 | circRNF13 可能通过抑制糖酵解来抑制 NPC 的转移和侵袭

4. circRNF13 如何抑制 NPC 细胞的糖酵解？

利用 RT-PCR 和 WB 检测糖酵解途径中的主要分子，结果显示 circRNF13 过表达时 GLUT1 蛋白表达水平显著降低，circRNF13 下调时 GLUT1 蛋白表达水平显著升高，GLUT1 mRNA 表达水平没有明显改变（图 A-B），提示 circRNF13 可能主要通过影响 GLUT1 蛋白稳定性来影响糖酵解。

利用蛋白合成抑制剂 CHX 处理细胞，证实 circRNF13 表达与 GLUT1 稳定性存在负相关（图 C）。进一步 IP 实验表明（图 D），circRNF13 主要是通过介导 GLUT1 的泛素化降解来抑制 NPC 细胞的糖酵解。

图 4 | circRNF13 通过促进 GLUT1 的泛素化抑制 NPC 细胞糖酵解

5. circRNF13 又是如何调控 GLUT1 泛素化的？

对上述 LC-MS/MS 蛋白组数据进一步分析发现， SUMO 蛋白家族成员 SUMO2在LC-MS/MS 蛋白组数据中显著改变。实验结果显示，在鼻咽癌细胞中过表达 circRNF13 显著上调 SUMO2 的表达，而敲低 circRNF13 可以下调 SUMO2 的表达，与质谱数据相吻合（图 A-B）。且在 NPC 细胞中过表达 SUMO2，可以抑制细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞的糖酵解。生物信息学预测结合 RNA pull-down、双荧光素酶实验证实（图 C-E），circRNF13 可以直接结合到 SUMO2 3’-UTR 区域，提高了 SUMO2 mRNA 的稳定性（图 F）。

图 5 | circRNF13 直接结合并稳定 SUMO2 mRNA 以促进其表达

WB 实验表明，circRNF13 可以促进 GLUT1 的 SUMO 化修饰。过表达 SUMO2 可以抑制 GLUT1 的表达，促进 GLUT1 的泛素化降解，从而抑制 NPC 细胞的糖酵解过程。以上结果表明，circRNF13 通过与 SUMO2 结合调控 GLUT1 泛素化。

6. circRNF13 通过 SUMO2 抑制 NPC 细胞的增殖、迁移和侵袭

进一步实验显示，过表达 SUMO2 可以挽救由 circRNF13 敲低所介导的 NPC 细胞增殖、迁移和侵袭以及糖酵解的改变（图 A-D）。同样，在裸鼠皮下移植瘤模型中，circRNF13 过表达可以引起 SUMO2高表达、GLUT1低表达（图 E）。表明 circRNF13通过 SUMO2 抑制 NPC 细胞的增殖、迁移和侵袭。

图 6 | circRNF13 通过 SUMO2 抑制 NPC 细胞的增殖和迁移

 研究结论 

本研究在鼻咽癌中鉴定到一个新的低表达 circRNA 分子 circRNF13，它可以作为抑癌因子，直接与 SUMO2 的 3’-UTR 结合，延长 SUMO2 mRNA 半衰期并上调其表达，通过介导 GLUT1 的 SUMO 化和泛素化促进 GLUT1 的降解，进而抑制 AMPK-mTOR 通路以抑制糖酵解途径，并最终抑制鼻咽癌细胞的增殖和迁移。

 参考文献 

Mo Y, Wang Y, Zhang S, et al. Circular RNA circRNF13 inhibits proliferation and metastasis of nasopharyngeal carcinoma via SUMO2. Mol Cancer 2021; 20(1): 112.