单细胞测序样本处理指南（三）- 细胞样本的冷冻保存和运输

制备好的单细胞悬液，如因实验时间或实验条件所限，不能立即进行单细胞测序实验，可选择将细胞样本进行冷冻保存和运输。建议在4周内复苏细胞样本并进行后续的单细胞测序实验。

一、细胞样本的冷冻保存

💠 新鲜制备的单细胞悬液，进行细胞计数及细胞活性测定后，可置于冰上暂时保存，以维持细胞活性。

💠 向程序降温盒的内夹层倒入250mL异丙醇，注意其它部位不能残留异丙醇，以防字迹溶解丢失。反复冻存5次之后应及时更换异丙醇，以维持最佳的程序降温能力。

💠 在待用的细胞冻存管外表面以及程序降温盒外，用记号笔详细地标注样本相关信息和冻存日期时间。

💠 将待冻存的单细胞悬液，室温离心300×g，5min，吸去上清，不要扰动离心管底部的细胞沉淀。

💠 用冻存保护液以5×105/mL的密度重悬细胞。为减少剪切力带来的细胞损伤，尽量轻柔缓慢地吹打液体。将1mL细胞悬液转移至冻存管中，随后拧紧冻存管旋盖。

💠 将装有样本的冻存管转移入准备好的程序降温盒中，随后将程序降温盒保持正面向上，切勿翻转或倾倒放置，于-80℃冰箱中降温平衡过夜。注：也可直接放入程序降温仪器中，设置按照1℃/min的速率降温（按此降温速率有利于降低冰晶形成的概率，减少细胞损伤和死亡）。

💠 次日取出程序降温盒，将装有样本的冻存管转移至液氮中长期保存，并记录相应的样本信息和冻存位置信息。

二、细胞样本的运输

冻存保存的细胞样本：建议置于干冰环境中维持冷冻运输（-78℃），寄送前请先预估运输时间，确保运输过程中保留有足够干冰，运输过程中注意做好缓冲保护。

三、细胞样本的复苏

💠 从液氮或干冰中取出冻存管，核对冻存管壁的样本信息及冻存日期准确无误。稍稍拧松冻存管盖，以确保若冻存管内还残留少量液氮，使其完全挥发，避免受热炸裂。

💠 在37℃温水浴中加热冻存管，并轻轻晃动以加速解冻过程，直至冻存管内的冻存保护完全融化（确保整个过程在1-2min以内完成）。

💠 从水浴中取出冻存管，用酒精棉对冻存管口及外表面进行消毒。

💠 将组织样本连同冻存液一起转移至新的15mL离心管，加入5mL事先预热的细胞完全培养基，轻柔吸打将液体混合均匀。

💠 室温离心300×g，5min，吸去上清，不要扰动离心管底部的细胞沉淀。

💠 加入合适的溶液，轻柔重悬细胞样本，用于后续生物实验。

四、冻存复苏注意事项

💠 如条件允许，建议可将同一次实验样本分多管冻存，以保证实验成功率。

💠 组织冷冻保存液中会含有DMSO等有毒性的有机试剂，操作时请务必带佩戴实验用手套、口罩，并避免皮肤、呼吸消化道以及眼睛直接接触试剂。

💠 对生物样本进行冻存复苏过程中，会频繁使用液氮。请佩戴护目镜等安全保护措施，并避免液氮飞溅泼洒，以免烫伤。